科研服务
SCIENTIFIC SERVICE
病毒包装
干扰慢病毒/过表达慢病毒构建
1.服务描述
干扰慢病毒构建：一般情况下，RNA干扰实验是通过化学合成小片段siRNA，或者构建shRNA表达质粒，通过转染试剂介导进入细胞实现RNA干扰。但是这两种方式对于难转染的细胞（例如原代细胞，干细胞，悬浮细胞等）往往因为转染效率低而导致RNA干扰实验失败。而通过构建慢病毒shRNA干扰质粒并包装病毒，再用病毒侵染靶细胞能很好的解决这一难题。
过表达慢病毒构建：cDNA过表达慢病毒包装是根据客户提供的目的基因信息，将其构建至所需的慢病毒过表达载体中，与其余的慢病毒包装辅助质粒共同转染HEK293T细胞包装获得过表达目的基因的慢病毒颗粒。
2.服务内容（干扰/过表达）
1：shRNA干扰靶点序列的设计/目的基因调取；
2：shRNA 慢病毒质粒的构建/过表达慢病毒质粒的构建；
3：shRNA慢病毒包装与病毒滴度测定/过表达慢病毒包装与病毒滴度测定；
3.服务说明
1：我们的RNA干扰及过表达服务针对所有的哺乳动物细胞，暂不提供植物和原核生物的RNA干扰服务；
2：对象可以是编码蛋白的mRNA序列，也可以是长的非编码RNA(lncRNA)序列；
3：针对不同的靶基因，我们一般设计3-4条干扰序列，保证至少有一条序列干扰效果大于70%（RNA水平）。也可由客户提供干扰靶点，但我们不保证干扰效果；
4：我们提供多个慢病毒载体供客户选择（见下方载体信息）；
5：我公司包装的shRNA干扰慢病毒颗粒滴度可以达到1×109TU/ml，完全能够满足动物实验；
4.客户所得
1：构建好的shRNA/过表达质粒及对照质粒；
2：合同规定量的慢病毒颗粒及对照病毒颗粒；
3：完整的实验报告（包括实验材料，实验步骤，实验结果等）；
5.载体信息
干扰慢病毒构建从靶点设计到慢病毒滴度测定完成需21个工作日；
过表达慢病毒构建从基因调取到慢病毒滴度测定完成需27个工作日；
miRNA 的过表达慢病毒包装
1.服务描述
microRNA(miRNA)是一类小片段单链RNA , 最初是在核内由RNA聚合酶转录形成具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAA)的pri-miRNA，pri-miRNA在核酸酶Drosha及其辅助因子Pasha的作用下被处理成约70个核苷的pre-miRNA。pre-miRNA被运输出核后再由另外一个核酸酶Dicer将其剪切形成约22个核苷酸的成熟miRNA。成熟的miRNA 与RISC组装成RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。
图示：miRNA的成熟过程
2.服务内容
1：miRNA 的过表达慢病毒包装
我公司采用扩增pri-miRNA及其两端的天然侧翼序列来构建miRNA的过表达质粒，并包装慢病毒。以实现miRNA在体外(内)的高表达。该方法相比化学合成的miRNA，具有可持续性表达，并且能用于难转染(例如干细胞，悬浮细胞等)细胞等优点。比pre-miRNA和mature miRNA 形式的过表达，具有表达效果更好，更能模拟体内天然的成熟过程。
2：miRNA的抑制
我公司采用TuD RNA(Tough Decoy RNA)的设计方法构建miRNA的抑制慢病毒载体。TuD RNA不同于以往的单链RNA，它是含有颈环结构的双链RNA , 能够抵抗胞内核酸酶的降解，让miRNA抑制可持续一个月以上。并且，TuD RNA的两条链都包含一个miRNA结合位点，能够更高效地隔离浓度较低的目标miRNA。因此，相比其它方法，TuD RNA能够更长效的抑制miRNA。
图示：TuD RNA的工作原理
3：miRNA的靶基因验证
由于miRNA是通过其seed sequence(5’端2-8位核苷酸)与靶基因的3’UTR结合抑制靶基因的表达。因此，我们将待定目的基因的3’UTR区域构建至报告基因luciferase的后面，通过比较实验组和对照组报告基因表达的改变(监测荧光素酶的活性变化)来间接反映miRNA对目的基因的抑制作用。同时结合定点突变等方法进一步确认miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
3.服务说明
1：客户只需提供miRBase数据库中的miRNA编号，我们就可以按照您的要求完成相关实验。
2：miRNA的过表达效果受诸多因素影响，与对照组相比，可以提高2—1000倍(如果本底表达水平较低，可以达到较好的过表达效果，如果本底表达水平较高，过表达效果会相对较低)。
3：我们提供多个microRNA慢病毒载体供客户选择(见下方载体信息);
4.客户所得
1：符合客户要求的产品(质粒+甘油菌 或者 病毒+polybrene);
2：完整的电子版实验报告(包括实验材料，步骤，载体图谱等);
3：完整的测序报告;
5.载体信息
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载体编号 |
携带标记 |
载体骨架主要元件 |
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荧光 |
真核抗性 |
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MicroRNA过表达慢病毒载体 |
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pHY-LV-miR1.1 |
无 |
无 |
CMV-GFP-MCS |
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pHY-LV-miR1.2 |
GFP |
无 |
CMV-GFP-MCS-PGK- Puromycin |
|
MicroRNA抑制慢病毒载体 |
|||
|
pHY-LV-KD1.1 |
GFP |
无 |
U6-TuD RNA-CMV-GFP |
|
pHY-LV-KD1.2 |
RFP |
无 |
U6- TuD RNA -CMV-RFP |
|
pHY-LV-KD1.4 |
无 |
puromycin |
U6- TuD RNA -CMV-Puromycin |
|
pHY-LV-KD2.1 |
GFP |
无 |
U6- TuD RNA -EF1α-GFP |
|
pHY-LV-KD3.1 |
GFP |
无 |
U6- TuD RNA -UBC-GFP |
|
pHY-LV-KD5.1 |
GFP |
puromycin |
U6- TuD RNA -CMV-GFP-PGK- Puromycin |
|
pHY-LV-KD5.2 |
RFP |
puromycin |
U6- TuD RNA -CMV-RFP-PGK- Puromycin |
|
pHY-LV-KD5.4 |
GFP |
puromycin |
U6- TuD RNA -UBC-GFP-PGK- Puromycin |
|
3’UTR报告基因慢病毒载体 |
|||
|
pHY-LV-Report3.1 |
luciferase |
无 |
CMV-luciferase-MCS |
