科研服务
SCIENTIFIC SERVICE
斑马鱼基因敲除突变体建立
1.敲除原理
功能缺失---基因敲除 (Gene Knockout)
基因敲除 :将斑马鱼基因改变成无功能性基因(无效等位基因：null allele)的一种遗传学技术
【A gene knockout (KO) is a genetic technique in which one of an organism‘s genes is made inoperative. http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_knockout 】
通过将基因敲除的个体与正常个体相比较，研究者可以揭示特定基因的功能。
基因敲除技术特点：在基因组水平上将目标基因修改成无效等位基因，遗传背景干净清晰，是研究基因功能的金标准。
2.服务流程
3.服务信息
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流程分布 |
周期（工作日） |
提交内容 |
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基因信息分析 |
2 |
专业分析报告 |
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sgRNA合成 |
9 |
获得sgRNA并提供sgRNA合成阶段报告 |
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sgRNA活性验证 |
5-10 |
获得有活性的sgRNA并提供活性报告 |
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F0代突变体鉴定 |
40 |
获得F0代突变体并提供鉴定报告 |
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F1代突变体获得 |
60 |
提供2尾（或以上）F1代突变体并提供总结报告 |
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总周期：4-5个月 |
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案例说明
案例说明
Ｘ利用CRISPR技术建立动物基因敲除突变体的实验流程
(以斑马鱼基因为例)
一、基因结构及功能的生物信息学分析
二、CRISPR 设计
三、目标序列的野生型等位基因的测序验证
3.1 扩增目标基因组片段的引物设计
3.2 基因组DNA模板制备
以斑马鱼为例，随机选取5枚24 hpf胚胎，以《超微量基因组DNA模板制备试剂盒》(南京尧顺禹生物科技有限公司)制备斑马鱼基因组DNA模板。
3.3 PCR产物电泳及测序验证
四、sgRNA体外表达模板的制备(质粒模板法)
本实验流程以南京尧顺禹生物科技公司的二合一质粒pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA(含sgRNA骨架的质粒)质粒特征所设计。
4.1 CRISPR寡核苷酸DNA(Oligo)对的设计
4.2 向可信赖的商业公司订购上述DNA引物(共2条，每个2 OD，RPC纯化即可)。
4.3 将正反向两个引物进行退火
4.4 将退火产物与线性化的pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA骨架质粒连接
4.5 转化
4.6 转化子鉴定
2%琼脂糖凝胶电泳，阳性克隆应出现113 bp的条带(图1)：
图1：PCR验证阳性克隆。Lane1：DNA Marker (从下往上, 100bp, 250 bp, 500bp, 750 bp, 1000bp, 3000bp, 5000bp);Lane 2-4: 阴性转化子; Lane 5-9: 阳性转化子
4.7 测序验证
送2个经PCR验证有阳性条带的菌液去商业公司测序，测序引物为F-sgRNA，确认CRISPR序列(去除PAM位点)和骨架序列重组到pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA质粒中;同时，将同样的细菌接种在10 ml含氨苄青霉素的LB管中，37oC条件下摇菌过夜。
4.8 质粒抽提
4.9 sgRNA模板的制备
以上述质粒为模板，选用引物F-sgRNA和引物R-sgRNA作为一对引物，用高保真DNA聚合酶，通过PCR的方式，进行sgRNA模板的制备。
五、sgRNA体外转录
用Maxiscript T7 Kit (Ambion)试剂盒，按说明书的要求进行sgRNA的体外转录。
说明：由于sgRNA在细胞内发挥作用的是RNA的形式，因而不需要戴帽以及加尾等操作。
5.1 20 ml体外转录体系(依次加入)
sgRNA模板：12 ml
10mM ATP: 1 ml (NTP均需在冰上溶解)
10mM CTP: 1 ml
10mM GTP: 1 ml
10mM UTP: 1 ml
T7 RNA polymerase：2 ml
10 × Transcription Buffer：2 ml (先在室温下溶解，然后Vortex，再离心后使用)
5.2 将上述溶液充分混匀后，离心，然后置于37℃水浴锅中孵育1h。
5.3 向反应体系中加入1ml DNase I，混匀，再次于37℃水浴锅中孵育15min。
5.4 向反应体系中加80 ml DEPC处理过的超纯水，10 ml 无RNase的3M醋酸钠(pH5.2)，涡旋混匀，然后加300 ml 无RNase的无水乙醇(购买来未打开过的新的无水乙醇可视为无RNase，于-20℃中骤冷1小时以上。
5.5 4℃，12000g 离心20min，弃上清。
5.6 以70% 无RNase的乙醇清洗沉淀，4℃，12000g 离心5min，弃上清。
5.7 然后再快速离心，将挂在离心管壁上的液体用移液器小心吸出。
5.8 通风橱中(打开抽气开关)干燥(20min左右)，若较长时间仍不能将沉淀物干燥，再次于4℃，12000g 离心5min，将挂在离心管壁上的液体用移液器(小量程的移液器)小心吸出。
5.9 加10 ml DEPC处理超纯H2O 溶解沉淀。
5.10 取0.5 ml sgRNA用2%的琼脂糖凝胶电泳检测转录出的sgRNA条带的完整性(图2)，并用紫外分光光度计测量转录出的sgRNA的浓度。
5.11 合成出的sgRNA应及时进行分装，保存在-80oC冰箱中，不要反复冻融，以免影响其质量。
图2、sgRNA (第2条泳道为sgRNA)
六、sgRNA活性的测试
将上述sgRNA和Cas9 蛋白混合，显微注入斑马鱼受精卵，注射量为1nl。待胚胎发育至7-24 hpf时，取5枚胚胎，使用本公司生产的《超微量基因组DNA模板制备试剂盒》制备基因组DNA模板，方法同前。
然后以引物对F-gene和R-gene进行PCR扩增，将PCR产物分别亚克隆到pGEM-T Easy载体中。以引物对T7和Sp6对转化子进行扩增，以筛选验证。
对筛选到的阳性转化子，以T7和Sp6扩增产物为模板，F-gene和R-gene再次进行PCR扩增。然后，依据条带大小，选20个克隆，5个一组，PCR产物等量混合后直接送测序。直接阅读测序图，只要其中任何一组出现有套峰，即假定制备的sgRNA活性不小于5%(1/20)。
图4 典型的测序套峰图
七、斑马鱼靶向基因突变体F0代的建立
将上述经过验证有活性的sgRNA和Cas9 蛋白等量混合后，按上述相同的方法显微注入斑马鱼受精卵。然后将按常规饲养，当生长至两月龄时，剪取尾鳍，按前述同样的方法进行扩增目标基因组DNA片段。将获得的PCR产物直接送测序，确认体细胞含靶向突变。然后将斑马鱼饲养至性成熟，共获得约50尾后代。
图5 典型的体细胞含靶向突变的测序套峰图
八、斑马鱼基因靶向突变F1代的制备
收取F0自交的胚胎，获得不少于100尾以上的F1。将F1按常规饲养至2个月时，选取10尾鱼，剪尾鳍，按前述方法进行基因型鉴定。简单地说，用南京尧顺禹生物科技有限公司的《超微量基因组DNA模板制备试剂盒》制备基因组DNA模板，再以引物对F-gene和R-gene进行PCR扩增。将PCR产物直接送测序，通过直接读测序的色谱图，确认每一位鱼是否携带等位基因突变。
九、基因靶向突变体的扩群建系
将携带基因靶向突变的F1突变体和野生型交配，获得F2群，完成基因靶向突变体的建系扩群。
参考文献
Ｘ参考文献
