
我想请问下sgRNA设计中,有些网站把PAM序列也弄到sgRNA里了,有些网站又没有,那我们设计sgRNA的时候需要把PAM也加进去吗?
发布时间:
2018-07-02
这里需要区别两个名词:CRISPR vs sgRNA;一些文献常将这两个词混用(我们最初的培训讲义也是混用的)。实际上,sgRNA是RNA形式的分子。在基因组编辑中,sgRNA引导Cas9靶向识别CRISPR序列,其中的PAM(CRISPR序列临近的3个核苷酸NGG为PAM)作为CRISPR序列在基因组上的一个标记,对于靶向识别至关重要,靶向识别的结果是Cas9的两个核酸内切酶结构域(两把”分子剪刀“)将PAM前的3-4核苷酸间的3'-5’磷酸二酯键切断,造成DSB(双链断裂)。DSB出现后,诱发细胞针对该DSB进行NHEJ或HR修复,产生不同编辑子。筛选不同的编辑子,有希望获得KO或KI的等位基因。从上述描述可以看出,CRISPR序列是一个DNA序列(不包括PAM),而由此合成的sgRNA则是用来识别该DNA序列的。张锋把CRISPR + PAM 序列称作Guide 序列,我们在讲课中使用这一说法。在使用软件设计CRISPR序列时,需要将目标DNA序列(包括假定的PAM序列)都输入,如果没有PAM,就不可能设计出CRISPR序列