我想请问下sgRNA设计中，有些网站把PAM序列也弄到sgRNA里了，有些网站又没有，那我们设计sgRNA的时候需要把PAM也加进去吗？

这里需要区别两个名词：CRISPR vs sgRNA；一些文献常将这两个词混用（我们最初的培训讲义也是混用的）。实际上，sgRNA是RNA形式的分子。在基因组编辑中，sgRNA引导Cas9靶向识别CRISPR序列，其中的PAM（CRISPR序列临近的3个核苷酸NGG为PAM）作为CRISPR序列在基因组上的一个标记，对于靶向识别至关重要，靶向识别的结果是Cas9的两个核酸内切酶结构域(两把”分子剪刀“)将PAM前的3-4核苷酸间的3'-5’磷酸二酯键切断，造成DSB（双链断裂）。DSB出现后，诱发细胞针对该DSB进行NHEJ或HR修复，产生不同编辑子。筛选不同的编辑子，有希望获得KO或KI的等位基因。从上述描述可以看出，CRISPR序列是一个DNA序列（不包括PAM），而由此合成的sgRNA则是用来识别该DNA序列的。张锋把CRISPR + PAM 序列称作Guide 序列，我们在讲课中使用这一说法。在使用软件设计CRISPR序列时，需要将目标DNA序列（包括假定的PAM序列）都输入，如果没有PAM，就不可能设计出CRISPR序列