南京大学模式动物研究所赵庆顺
新型冠状病毒2019-nCoV正肆虐全国，造成了巨大的社会危机。有关本次流行的病毒是否为人为制造（故意投毒）以及是否是从实验室泄漏出来的问题正引起全社会的高度关注。本文通过对相关病毒的基因组序列进行比对分析，推论新型冠状病毒2019-nCoV既不是人为制造也不是从实验室泄漏，而是很早就存在于蝙蝠和/或中间宿主身体中！
作为争议的核心，持肯定答案的争议方把中科院武汉病毒所石正丽研究员作为共同作者或通讯作者发表的两篇论文作为主要依据。这两篇研究论文分别是：
1）Menachery et al., 2015 A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence. Nat Med. 21(12):1508-13. doi: 10.1038/nm.3985.
2）Zhou et al., 2020. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. Feb 03 (online).
一、冠状病毒2019-nCoV是否是人为制造的病毒？
2015年的论文报道了用基因工程手段人工创制“功能加强”版的可感染人的冠状病毒。该项研究在当年就引发很大争议！在这篇论文中，石教授因为提供了一种中国蝙蝠冠状病毒编码的S蛋白的序列和质粒而被列为共同作者。
在该论文中，来自美国北卡大学的研究者将一种源自中国蝙蝠冠状病毒编码的S蛋白基因重组到可感染小鼠细胞CoV的骨架中（该骨架来自SARS病毒），人为制造了一种新的、地球上过去没有出现过的冠状病毒SHC014-MA15，该病毒可以感染小鼠细胞和人细胞，也能使小鼠致病。这一研究结果揭示这样一个重要的现象：来自蝙蝠冠状病毒的S蛋白可与人细胞上的受体ACE2直接结合，从而导致病毒感染人。当然，S蛋白要发生这样的作用，必须要一个冠状病毒骨架的支持。这也是论文中为什么要将S蛋白基因重组到来自SARS-CoV骨架上的原因。
在证实了来自蝙蝠病毒中的S蛋白可以直接感染人且使小鼠致病后，研究者又合成了另外一个人工病毒SHC014-CoV，这个病毒虽能在人细胞中快速繁殖但并不能使小鼠致病。
论文由此推论，来自蝙蝠的冠状病毒可能不需要通过果子狸这个中间宿主再感染人，而是直接感染人，然后再感染果子狸。
可见，2015年的研究论文提供了如下结论：1) 蝙蝠冠状病毒编码的S蛋白能够与人的ACE2受体相结合；2）冠状病毒感染人还需要有适合于感染人的病毒骨架。但即便以上两个要素都具备，病毒也还可能不具备毒性。
而石教授刚发表的2020研究论文指出：本次爆发的新型冠状病毒2019-nCoV与蝙蝠冠状病毒RaTG13的基因组序列相同性为96%。查阅美国国立卫生图书馆的基因库数据发现，RaTG13的基因组数据是2020年1月27递交的（基因库登录号：MN996532）；基因库同期还公布了多个2019-nCoV病毒的基因组序列，不同来源的序列几乎一样，相同度均为99.99%。这也是论文推论2019-nCoV源自蝙蝠的依据。
这里，我们选用由美国疾控中心于1月28日上传的2019-nCoV基因组数据作为分析对象（基因库登录号：MN997409）。我们发现，2019-nCoV与RaTG13各自编码的S蛋白相同性非常高，达到96.7%（图一）。
2019-nCoV编码的S蛋白能够与人ACE2结合（2020论文证实）。不过，我们现在还不知道来源于蝙蝠冠状病毒RaTG13编码的S蛋白是否可以直接结合人ACE2，毕竟这两种S蛋白存在3.3%的差异。而且，虽然两种病毒的S蛋白中与人ACE2受体相结合的5个与宿主相关的关键的氨基酸残基（Y442、L472、N479、T487和Y491）相同，但其临近位置的氨基酸残基存在较大差别，合理推测可能会影响与人ACE2的结合。
退一步说，即使RaTG13编码的S蛋白能直接结合人ACE2，但RaTG13骨架是否具备感染人的能力目前也是不知道的，毕竟二者有约4%的核苷酸序列的差异。
因此，可以合理假设，源自蝙蝠的病毒RaTG13不具有感染人的能力。退一步说，如果蝙蝠的病毒RaTG13具备感染人的能力的话，采集者自己应该已经最先被感染；同时，（投毒者）也应该没有必要去人工合成一个新的2019-nCoV，因为直接用RaTG13去感染人即可。
那么，是否存在这样一种可能：研究者首先获得了源自蝙蝠的冠状病毒RaTG13，然后出于某种目的通过基因工程手段（如基因重组和基因编辑等）对RaTG13进行改造，使之获得感染人的能力？
为证伪这种假设，我们将冠状病毒2019-nCoV和RaTG13分别与基因库中的已知冠状病毒基因组进行序列比对，我们发现：2019-nCoV与其它冠状病毒的序列相差很大，其中与蝙蝠冠状病毒（除RaTG13）的相同性均不到90%，而与已知SARS病毒的相同性则只有不到83%（图二）。
由此，我们可以做这样的推论：人工创造一个可以感染人的病毒会出现一个动机上的悖论，那就是如果要故意制造一个可以感染人的病毒的话，为什么不直接用已知的策略（如2015年论文所描述的那样，用已知的S蛋白和已知的病毒骨架），而非要舍近求远的采用依据与SARS序列有17%差异的RaTG13为基础进行基因改造？须知，在出现2019-nCoV前，人类仅知道S蛋白可以跨物种结合ACE2，还完全没有关于差别如此之大（差17%）的冠状病毒（RaTG13）骨架可以感染人的知识。
有质疑者还会提出疑问，是否可能没有任何理由实验室“不小心”通过基因改手段造创制出来的？
须知，基因改造并不是一件容易的事，实施基因改造需要非常专业的知识与技能，而且需要大量的投入的（因为需要不断试错）。特别地，在对RaTG13骨架和S蛋白的编码基因的功能不了解的前提下，凭空预测哪些改变可增其强感染人的能力，是几乎不可能的。此外，在大约3万个核苷酸中（RaTG13的基因组大小为29855 nt）出现4%差异（与2019-nCoV相比，而与SARS相比则有17%的差异）的不同种类病毒数理论上是一个天文数字，理论上，因“不小心”（随机）而获得2019-nCoV的机会几近于0。因此，2019-nCoV不可能是不小心创制出来的。
那么，有没有可能是全人工合成出来的？
技术上，如果知道了序列，那么合成一个3万核苷酸长的基因组是没有问题的（当然比较难，特别地，合成出来的DNA片段要变成有活性的RNA病毒不是一个容易的事，技术门槛是很高的，全世界现在能做这件事的估计也没有多少人）。但如果不知道序列，仅凭生物计算就预测出一个完全有功能且与RaTG13存在4%差异的人造病毒全基因组序列是几乎不可能的，因为我们不知道这个病毒是否可以感染人细胞，每一处的改变（突变）是否关键都需要论证。更何况，RaTG13与2019-nCoV之间的4%差异非常符合自然突变累积的结果（见第二部分内容）。因此，2019-nCoV是全人工合成出来的可能性接近于0.
总之，我们的分析不支持这个nCoV-2019是人工创造出来的病毒。
二、病毒是否是从实验室泄漏出来的?
这个也几乎不可能。
我们不知道石教授何时采集到的蝙蝠冠状病毒RaTG13（这个序列刚于2020年1月27日发表）。但我们不妨用另外一种方式思考这个问题：假定病毒就是泄漏出来的。由于2019-nCoV与RaTG13的相同性是96%，存在约4%的差异。因此，按照基因进化（自发突变）的频率进行评估，要获得这4%的差异应该不是短时间内可以实现的。人与猩猩的遗传基因相比有约1.2%的差别，进化上，两者共同的祖先至少要追溯到400万年前。当然，病毒主要是以RNA单链为遗传物质，发生突变的可能性会更大，但毫无疑问依旧符合进化论）。
作为自发突变的一种普遍现象，突变位点在整个基因组中理论上是随机出现的。观测2019-nCoV与RaTG13全基因组序列比对的结果，我们可以发现：两种病毒基因组间核苷酸的差异恰恰是随机出现在整个基因组中，并没有什么特别集中的区域（图三）。
所以从这个意义上来说，这个2019-nCoV更有可能很早就存在于某个物种中（如蝙蝠、中间宿主如竹鼠等宿主之中）。
那么，质疑者或许还会问，2019-nCoV会不会就是直接来自采集到的蝙蝠病毒，科学家采集到后不小心从实验室泄漏出来了？
这一点比较容易证伪。如果是的话，采集的人应该会被首先感染，因为有举报者说石教授团队是在未作任何防护的情况下采集的蝙蝠病毒！所以从实验室泄漏也就无从说起。
总之，我们的分析结果不支持病毒是从实验室中泄露漏出来的
2020年2月3至5日讨论于生物90微信群和大学同学群，2月4日由南京尧顺禹生物科技有限公司池军协助整理，题目由大学同学陈亚林建议，2月5日上午9:38定稿！
图一、2019-nCoV与RaTG13各自编码的S蛋白氨基酸序列相同图（96.7%的相同性）
图二、2019-nCoV与其它冠状病毒基因组序列比对图（部分截图）
图三2019-nCoV与RaTG13基因组序列比对图
