专家点评NEJM |世界首例！陈虎/邓宏魁/吴昊合作团队报道首例CRISPR编辑干细胞治疗HIV和白血病患者

作为最先进、最热门的基因编辑技术，CRISPR-Cas9技术被广泛用于编辑哺乳动物细胞的基因组，具有非常巨大的临床应用潜能。目前，CRISPR为基础的疗法已经开始临床试验（NCT03655678、NCT03399448），以研究其安全性和可行性，但试验的结果还没有报道。

同种异体移植天然携带CCR5突变的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）能够长期根除HIV-1，CCR5是HIV入侵的关键共受体。10年前，曾有一位感染了HIV-1的“柏林患者”通过造血干细胞移植治疗急性髓系白血病，而供体细胞恰具有CCR5Δ32/Δ32 突变，骨髓移植后，患者的HIV得到长期缓解【1】。但是当时那个单一的病例并不能反映到底哪种治疗手段或患者因素是缓解HIV的原因，毕竟骨髓移植手术还需要进行全身辐射。

10年后的2019年3月6日，来自英国伦敦大学学院、剑桥大学等处的科学家在Nature发表的一篇题为HIV-1 remission following CCR5Δ32/Δ32 haematopoietic stem-cell transplantation 的论文【2】，报告世界上第二例经干细胞移植后HIV-1感染得以缓解的病例。截止到论文发表的时间为止，患者的病情已经缓解了18个月，但是作者提醒，要说患者的艾滋病已经“被治愈”还为时尚早。

因此移植人为突变CCR5的细胞或许是抵抗HIV-1感染的替代性疗法。2017年8月，北京大学邓宏魁教授实验室联合307医院陈虎实验室发展出一种无病毒的CRISPR基因组编辑系统【3】，在人HSPCs中突变CCR5，效率达到27%；而且在小鼠模型中显示，CCR5突变的HSPCs能够在小鼠中重建人类免疫系统，抵抗HIV-1感染。那么CCR5编辑的HSPCs在人体内是否能够抵抗HIV感染，其安全性和有效性又是如何呢？

Credit：BioArt

2019年9月11日，邓宏魁教授、307医院的陈虎教授（解放军总医院第五医学中心全军造血干细胞研究所所长、教授，军事医学研究院原附属医院造血干细胞移植科主任医师，2019年7月24日20时50分在北京因病不幸逝世，享年57岁）以及北京佑安医院吴昊教授研究组合作在The New England Journal of Medicine杂志上发表文章CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia，报道了首例利用CRISPR-Cas9在HSPCs中编辑CCR5基因并成功移植到罹患HIV和急性淋巴细胞白血病的患者案例，移植治疗使病人的急性淋巴白血病得到完全缓解，携带CCR5突变的供体细胞能够在受体体内长期存活达19个月，初步探索了该方法的可行性和安全性，但比例仅有5%，需要进一步优化治疗方法。可以预见的是，该临床试验报告将会推动全球范围内基于CRISPR基因编辑手段用于临床治疗，其意义不言而喻。

据文中报道，该病人为27岁男性，在2016年5月14日和5月30日分别诊断患有HIV-AIDS和急性淋巴细胞白血病（T细胞型）。随后立即接受抗逆转录病毒治疗，1年后HIV感染得到控制，在血清中检测不到病毒RNA。病人接受6个疗程标准的化疗治疗后，其形态上达到完全缓解。供体细胞来自中华骨髓供体库的一名33岁男性，其HLA配型完全匹配，CCR5基因没有突变。2017年7月9日，病人在清髓后，接受异体干细胞移植。干细胞移植的细胞由两部分组成：动员后外周血单核细胞分离出CD34+HSPCs，接受CRISPR编辑CCR5基因；剩下的单核细胞（由于分离效率，有部分CD34+细胞，占总CD34+细胞的28.8%，也就是说71.2%的CD34+被分离出来进行了基因编辑）。病人同时接受抗逆转录病毒治疗、移植物抗宿主病预防用药。

移植治疗后，13天和27天分别出现中性粒细胞和血小板重建；淋巴细胞和T细胞亚群增加，CD4细胞在6个月时恢复到正常范围并稳定；3个月时，血小板出现短暂减少，随后自行恢复到正常范围并稳定；4周后，实现了完全的供体嵌合，并维持到了19个月。移植后4周，病人的急性淋巴白血病达到形态上的完全缓解，并维持到随访的19个月。

利用非病毒方式转染CRISPR-Cas9对HSPCs（CD34+）细胞进行基因编辑，基因测序结果显示CCR5发生插入和删除突变（indel）的效率是17.8%。由于CD34+细胞分离效率限制，19个月长期的重建过程中，CCR5突变在骨髓有核细胞的比例范围是5.20%到8.28%。CCR5突变比率显示CD19+、CD33+、CD235a+细胞的编辑效率略高，CD4+、CD8+细胞稍低。结果显示，CRISPR编辑的HSPCs成功在病人体内重建，能够分化成多种谱系细胞，并保持基因编辑状态。

移植治疗过程中，病人出现2～3度的造血干细胞移植常见的并发症，经常规治疗后都得到缓解；没有发现与CCR5基因编辑相关的副作用事件。利用高通量基因测序技术检测基因编辑的脱靶效应，经过综合排查，仅有14个位点检测出Indels，且仅有1bp的突变，经逐个分析考虑并不是真正的脱靶事件。收集移植后15周、12个月、19个月的骨髓血样本，全基因组测序检测并无脱靶效应，而且没有染色体重排或长片段删除。

之前的研究显示自体移植CCR5突变T细胞能够在中断抗病毒治疗期间，降低病人体内的病毒载量【4】，提示CCR5删除突变或许能替代长期使用抗逆转录病毒疗法。研究人员对CCR5编辑HSPCs能否抵抗HIV-1感染进行测试。经过伦理委员会批准及病人的同意后，暂时中断抗逆转录病毒治疗，4周时血清中病毒载量增加到3*10⁷/ml；恢复药物治疗后，病毒载量降低。抗逆转录病毒治疗中断期间，外周血CD4+细胞降低，CD4/CD8比例降低；CD4+细胞中CCR5突变的比例有所增加。移植6个月后，CD4+细胞恢复至正常范围。移植8个月和19个月后，检测外周血样本发现HIV病毒的噬性并没有发生改变（依然为CCR5噬性）。

总的来说，本文报道了一例利用CRISPR编辑CCR5的HSPCs干细胞移植治疗罹患HIV和急性淋巴白血病病人的案例。研究人员利用一种新型的非病毒转染方式高效率地编辑CCR5基因，编辑的干细胞能够分化成多种谱系细胞，且保留CCR5编辑效果，维持达19个月；本次干细胞移植治疗使病人的急性淋巴白血病得到形态上完全缓解，另外也并没有出现明显的编辑后副反应，但对抵制HIV感染效果欠佳，需要进一步探索。

值得一提的是，邓宏魁教授正是CCR5的发现者。在1996年发表的一篇Nature文章中【5】，邓宏魁教授在纽约大学从事博士后研究时（1995-1997年）作为第一作者发现了CC-CKR-5（即CCR5），该研究是HIV领域内里程碑式的发现。目前该文章已被引用超过4300次。

值得一提的是，NEJM同期还发表了美国科学院院士、宾夕法尼亚大学终身教授Carl H. June撰写的题为Emerging Use of CRISPR Technology — Chasing the Elusive HIV Cure的评论。评论认为“该工作的安全状况似乎是可以接受的，尽管相关数据仅限于该病例研究。值得注意的是，为了确保方法的安全性，需要更长时间对病人进行随访。一个令人瞩目的方面是，本研究报告将基础研究快速转化成为了临床1期试验。而在宾夕法尼亚大学，从动物实验概念证实到人的临床试验需要5年，而在本研究中只用了2年。”此外，Carl H. June对媒体还表示，“该研究对相关领域来说非常好，而且没有引发伦理上的担忧”。

原文链接：

https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1817426?query=featured_home

https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMe1910754

专家点评

张林琦（清华大学艾滋病综合研究中心主任）

自从1981年艾滋病的发现，1983年艾滋病病毒(HIV)被分离并确定为艾滋病病原体的三十多年以来，我们对HIV生物学和人体抗HIV免疫应答开展了系统的研究，研发成功多种抗HIV药物。这些药物的优化组合（鸡尾酒疗法）能够有效抑制HIV的复制，为降低艾滋病患者的死亡率，降低HIV传播，提高感染者的生活质量起到了关键性的作用，使一种为早期医学宣判为死刑的疾病转为一种可治疗和可控制的慢性疾病。但目前使用的这些抗HIV药物，仍然无法把HIV从体内根本清除。其主要原因是HIV的高度变异和潜藏在人体的细胞内，巧妙地躲过了人体免疫系统和抗HIV药物的识别，对治愈艾滋病提出了严峻的挑战。

当前，在艾滋病治愈的研究领域，活跃着三个主要的研究方向和策略。第一是潜藏库的清除，其中如何特异识别和激活潜藏库，并加以抑制和杀伤，是研究的重点和难点。第二是利用多种免疫学手段，提高感染者抗病毒免疫水平，最终达到有效控制和彻底清除病毒的目标。主要包括广谱中和抗体、多种免疫细胞（CART，TCRT，CAR-NK等）、免疫因子和治疗性疫苗的研究。第三是基因治疗，利用近几年逐步完善的基因编辑技术，比如ZFN，TALEN和CRISPR/Cas9等，开展对艾滋病病毒靶细胞的基因修饰，特别是对T淋巴细胞和造血干细胞等体细胞第二受体CCR5基因的定点敲除，建立能够抵抗艾滋病病毒感染的细胞屏障，重建免疫系统，达到“功能性治愈”和“完全治愈”的目的。“柏林病人”和“伦敦病人”就是利用“天然”CCR5基因缺失（CCR5-Δ32）治愈艾滋病的典型范例。但由于这天然缺失在自然界概率少的可怜，因此，通过基因编辑敲除成体造血干细胞CCR5基因，再将编辑后的细胞移植到艾滋病患者体内成为了“功能性治愈”艾滋病的新策略。有必要强调的是，这里面提到的基因编辑技术的应用是以体细胞为靶标，与前一段时期报道的“贺建奎事件”中以生殖细胞和生殖为目的基因编辑CCR5基因，是完全不同的动机和目标。

今天，《新英格兰医学杂志》（The New England Journal of Medicine）发表了由北京大学邓宏魁研究组、解放军总医院第五医学中心陈虎研究组及北京佑安医院吴昊研究组合作，在基因治疗艾滋病研究的重要成果。研究论文的题目是《利用CRISPR基因编辑的成体造血干细胞在患有艾滋病合并急性淋巴细胞白血病患者中的长期重建》（CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia）。这是世界上首次报道通过基因编辑技术敲除人体造血干细胞CCR5基因，回输给患有艾滋病及急性淋巴细胞白血病患者，在安全性和有效性等研究方面，获得了宝贵的数据，取得了长足的进步，为我们进一步完善利用基因编辑技术治疗和治愈艾滋病提供了重要的参考和指导。

研究论文显示，利用前期优化的CRISPR/Cas9基因编辑造血干细胞技术，在供者来源的CD34+细胞上实现了17.8%的CCR5基因敲除效率。在移植后的19个月随访中，患者白血病处于完全缓解状态，供者型细胞完全嵌合，骨髓细胞基因组能够持续检测到CCR5基因编辑。在探索治疗艾滋病有效性方面，研究团队暂停了抗艾滋病药物治疗。在停药期间，外周血病毒载量从检测不到反弹到每毫升3×10⁷拷贝，CD4+ T细胞数量从每微升的575下降到250。而带有CCR5敲除的CD4+ T细胞从2.96%增加到4.39%，相当于提高了1.5倍。提示CCR5基因编辑的T细胞具备抵御HIV的入侵的能力和一定程度的生存优势。此外，通过对患者移植后多个骨髓样本的全基因组分析，并未发现基因编辑的脱靶效应和相关的副作用。

这些研究成果表明，成体造血干细胞基因编辑和移植，在艾滋病及急性淋巴细胞白血病患者体内具备良好的安全性和免疫重建的有效性。编辑后的成体造血干细胞能够在患者体内实现长期稳定的基因编辑效果，并重建人体造血系统。然而，对于艾滋病的治疗效果与未经过基因治疗患者相比差别不大，主要反应在短暂的停药期间，病毒反弹和CD4+ T细胞下降等方面。这种现象的发生，很有可能是移植的成体造血干细胞本身是CCR5基因野生型和敲除的混合体，其中带有野生型CCR5基因的CD4+T细胞，为病毒的复制和反弹提供了场所。从这个意义上讲，报道的病人更接近于“波士顿病人”的情况，突显提高基因编辑效率的重要性。此外，在停药期间，带有CCR5敲除的CD4+ T细胞比例和数量都有所增加，也许真的验证了人们所期待的那种敲除细胞面对艾滋病病毒感染的生存优势。由于病人随后接受了抗病毒治疗，对这个问题的回答还需要进一步的研究。再者，反弹病毒的来源一直是困扰研究领域的难题。如何在成体造血干细胞基因编辑和移植之前，清除患者体内的艾滋病病毒，防止嵌合免疫重建细胞感染，阻止病毒复制和反弹，同样是提高治疗效果的关键。

总之，今天的研究报告，为我们利用成体造血干细胞基因编辑和移植技术治疗艾滋病提供了宝贵的信息和经验，对一些关键的结论和临床表现，还需要对患者开展长期随访观察。但是随着造血干细胞和诱导性多能干细胞（iPSC）研究的进展，以及基因编辑技术和递送效率的提高，我们有理由相信，新一代的基因编辑技术一定能够在治疗和治愈艾滋病的道路上发挥更大的作用。届时，一定是对英年早逝的陈虎教授最好的追忆和怀念。

专家点评

程临钊（中国科学技术大学生命科学与医学学部讲席教授，约翰霍普金斯医学院终身教授）

中国人民解放军307医院（解放军总医院第五医学中心）陈虎研究组、北京大学邓宏魁研究组以及北京佑安医院吴昊研究组合作，在《新英格兰医学杂志》（NEJM）刚刚发表了题为CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia的原创性研究论文。这篇短幅的文章是基于CRISPR编辑人的成体造血干细胞，对HIV-1的目标基因CCR5（共受体）进行编辑，实现了基因编辑后的成体造血干细胞移植后在此病人（该患者同时患有艾滋病和急性淋巴细胞白血病）造血系统的重建。他们经过仔细的检测，并没有看到脱靶或其它的遗传相关的副作用。该工作探索了使用基因编辑在人成体干细胞中精准基因治疗的可行性和安全性。相信这个刚刚发表的工作，会进一步推动相关领域的发展。

CCR5也就是HIV-1入侵T细胞的共受体（邓宏魁教授当年是共同发现者之一）。在过去30多年都是HIV-1 病毒和艾滋病研究的关注对象。很多研究者也都在考虑怎么去除CCR5的生物学活性，从而得到可以抵抗HIV-1 入侵的T细胞，在过去十多年里最为出名的“柏林病人”和“伦敦病人”，由于供体造血干细胞正好携带CCR5缺陷型突变，血清中的HIV病毒得到了有效的清除。但这种方法的可推广性是有限的，其中一个原因是天然的，有CCR5缺陷的供体是极少数，尤其在亚洲人群里面。因此很多科学家都尝试通过不同的方法，比如用基因编辑，人为去除CCR5的活性。

此研究是用成年供者的造血干细胞，通过基因编辑的方法突变（灭活）CCR5基因，再通过经典的造血干细胞移植回输给病人。此艾滋病病人同时患有急性淋巴细胞白血病需要行异体造血干细胞移植治疗。所以在突变CCR5并做了移植后，移植的造血干细胞生产的T细胞就能够抵抗HIV-1的入侵。

这篇转化型的研究在很多方面都做得很出色。第一个是遵守了医学伦理，有病人知情同意书，在按照国际规范做的很好；第二方面，在技术上也把他们过去几年，尤其是邓宏魁团队在过去数年中采用基因编辑的新技术，如非病毒的方法，把关键的蛋白和guideRNA的复合体，通过电转的方法输进人的造血干细胞。这样避免了外源DNA的引入，更没有插入干细胞的染色体里面, 在干细胞里面也降低了存在的脱靶效应。

重要的是，此研究用人的成体造血干细胞做基因编辑. 虽然靶向基因也是CCR5，但是同去年被媒体大肆报道的贺建奎博士做的事有很大的不一样。贺建奎博士采用的是人的受精卵,最终产生基因修饰的婴儿。这样人体生殖系和体细胞系所有的细胞都会有CCR5突变。虽然CCR5 基因灭活的初衷是，婴儿的T细胞应该抵抗HIV-1 的入侵和进一步感染，但CCR5 基因灭活是否会对胚胎和成体细胞生理活性和功能的可能影响，现在不太明了。

公开报道的贺建奎工作，众所周知，有很多瑕疵和违规行为。目前具体细节还在进一步的调查，但科学界和社会普遍谴责贺的以人类生殖为目的基因编辑工作。这篇刚在NEJM上发表的工作，本质上是与贺的公共场合和媒体上报告不同。这次刚发表的工作，是在人的成体造血干细胞中做CCR5 的基因修饰。人类造血干细胞移植已经用了50多年，基本上在全世界不管欧美国家还是在中国都没有什么争议。这项技术已经治愈和帮助了无数病人。此工作进一步使用基因编辑，完善基因和细胞治疗，使像这一类的绝症病人也能够得到有效的根治。

最后我想说的是，此文章最后一位作者也是共同通讯作者陈虎教授是中国造血干细胞领域的优秀人物，在此研究中起到关键的作用，只是不幸的是陈虎教授在此文章修订期间英年早逝。这篇文章的发表也是对陈虎教授最好的怀念。

陈虎教授（1962-2019），全军造血干细胞移植中心主任、全军造血干细胞研究所所长、血液病专业委员会副主任，曾牵头的“成体干细胞救治放射损伤新技术的建立与应用”获得国家科技进步一等奖，“间充质干细胞在急性放射病干细胞移植中诱导免疫耐受的研究”获得军队科技进步一等奖，2016年获得“何梁何利基金科学与技术进步奖”。曾荣立一等功1次、二等功1次、三等功1次。姜锡娟摄影

现在，国内外有很多研究者进一步推动和完善基因编辑在临床上的应用。除了艾滋病以外，此方法可用于其他血液和免疫系统的疾病治疗，比如在国内比较常见的血友病和地中海贫血等。此篇文章的发表也会有助于其他团队进一步完善相关技术。此研究除了艾滋病以外，对其他用造血干细胞治疗的血液和免疫相关的疾病，都将会带来新的推动。

制版人：珂

参考文献

1. Hütter G, Nowak D, Mossner M, et al. Long-term control of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 stem- cell transplantation. N Engl J Med 2009;360:692-8.

2. Gupta, R. et al. HIV-1 remission following CCR5Δ32/Δ32 haematopoietic stem-cell transplantation.Nature https://doi.org/10.1038/s41586-019-1027-4 (2019).

3. Xu L, Yang H, Gao Y, et al. CRISPR/Cas9-mediated CCR5 ablation in human hematopoietic stem/ progenitor cells confers HIV-1 resistance in vivo. Mol Ther 2017;25:1782-9.

4. Tebas P, Stein D, Tang WW, et al. Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV. N Engl J Med 2014;370:901-10.

5. Deng, H., Liu, R., Ellmeier, W., Choe, S., Unutmaz, D., Burkhart, M., ... Dan R. Littman & Nathaniel R. Landau (1996). Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1. Nature, 381(6584), 661.