前言
多种证据表明循环EV参与生理和病理环境中的细胞-细胞通讯。尽管现在他们的细胞生物学在体外得到了更好的了解，但由于缺乏适应小型EV的动物模型，它们在复杂生物体中如何在亚细胞水平上表现仍然难以评估。斑马鱼胚胎允许循环EV从其原始细胞到其靶细胞的可视化，并允许在发育或肿瘤进展期间进一步探索它们的命运和功能。在未来，斑马鱼系统肯定有助于扩展在整个生物体水平上的EVs知识。
细胞外囊泡（EV）在所有生物的体液中循环，它们参与细胞间跨器官交流。跟踪和理解这些纳米尺寸的物体一直受到成像技术的低分辨率和缺乏适当的动物模型的阻碍。斑马鱼胚胎的使用允许使用光学和电子显微镜以前所未有的时空分辨率观察EV。这使得能够并排研究内源性生理EV和病理性EV，并进一步揭示其在整个生物体中的生物发生，生物分布和靶细胞的机制。这些发展将有助于更好地理解EV的体内生理学。
生物发生和分泌
EV是膜囊泡的异质集合，其富含蛋白质，遗传物质和脂质的子集，反映了细胞类型和起源细胞的生理状态。它们来自晚期内体-通常被称为外泌体-或直接从质膜（PM）发芽，在这种情况下它们被称为微泡。除EV家族的这两个主要成员外，还描述了其他细胞外结构，如凋亡小体，外显子，以及斑马鱼胚胎中涉及的migrasomes，并已在人血清中检测到。8月7日巴黎圣安妮大学精神病学和神经科学团队在Trends in Cell Biology查看期刊详情上发表了“Extracellular Vesicles: Catching the Light in Zebrafish”，本综述主要关注外泌体和微泡。
EV最近的进展以深入描述EV的各个亚群已经导致建立了一个共同的命名法，以通过它们的大小（大和小EV）或它们的起源（外泌体与微泡）来区分EV亚群。然而，尺寸，密度和组成通常在EV亚群之间重叠。因此，仍然完全确定PM衍生的小EV与组织或功能中的内体衍生的EV的差异程度。外泌体和微泡对体内EV总量的各自贡献同样仍然是未解决的问题。它们在体液中的高丰度与建议的短半衰期相结合表明体内持续分泌。尽管如此，各种报告表明EV可能以组成型和诱导型方式释放，并且可能依赖于细胞类型。了解EV生物发生，摄取和功能已经从体外和体内研究中获益。然而，EV分泌的实时可视化长期以来是不可能的，这阻碍了细胞类型和组织中EV生理释放和摄取率的仔细评估。因此，对体内EV半衰期的详细分析以及对不同EV生物发生和释放机制的相对贡献的仔细评估已经落后。最近开发的方法现在允许通过体外和体内的单细胞可视化EV释放，即使可视化体内释放过程本身仍然在技术上具有挑战性。
具体地说，外泌体报告基因CD63-pHluorin的组织特异性表达揭示了发育中的斑马鱼胚胎以同线蛋白-a依赖性方式分泌大量外泌体。在这种情况下，斑马鱼模型增加了之前在体外描述的EV生物发生途径的极少数体内研究。通过利用斑马鱼中的组织特异性启动子，可以使用类似的方法来确定体内每个组织的外泌体和微泡的生理分泌速率和局部扩散。有趣的是，循环EV的水平随着生理状态的变化或在各种病理发展期间而增加。因此，当扰乱体内平衡和/或EV间隙受到干扰时，EV分泌水平可能会增加。这些假设现在可以使用已建立的斑马鱼病理模型来解决，其中已知EV发挥核心作用。总体而言，EV释放的体内成像将有助于在生理和病理条件下确认并进一步探索EV分泌组织。
Figure 1：斑马鱼，解除体内细胞外囊泡（EV）的秘密的新模型。
运输：身体流体的传播和行为
高时空分辨率的体内成像可以揭示EV如何在分泌细胞周围扩散，它们如何穿过生物屏障，以及最终它们如何在通过身体传播之前到达循环。在体内，大多数细胞不与血液直接接触，而是与间质液隔室构成，其占细胞外总体液体积的约75％。有趣的是，在斑马鱼胚胎的间质液中可以发现大量的内源性YSL外泌体。因此，这个隔间可能是被忽视的EV储存器，并且可能在体内平衡或病理学中起重要作用。它可能作为EV向血管或淋巴管的运输途径，最近已被证明含有大量的EV。或者，EV可通过其他机制到达远离血管的细胞。实际上，多项体内研究表明，EVs可以跨越细胞屏障，但所涉及的确切机制仍有待确定。这在已知血管异常可渗透的癌症中尤其相关。
在这种情况下，斑马鱼胚胎提供复杂和刻板的血管网络，适用于循环中EV的行为及其远程分散的精细解剖。血液中EV的快速成像显示，与大血细胞相比，EV跨越血管的整个宽度。这种特殊的分布可能会影响EVs的停滞和内化，而EV的进一步由其表面粘附分子介导。此外，发现循环EV在静脉区域比在动脉中更有效地停滞，这表明流动力直接影响它们靶向特定血管区域的能力。
摄取：细胞识别和机制
在小鼠中-检测灵敏度有限-注入血液循环的EV积聚在少数特定器官中。此外，据报道，特定器官靶向取决于存在于肿瘤EV表面的整联蛋白库。需要进一步的工作来描述EV负载的整合素如何机械地确定这种特异性。这可能是由于器官依赖性富集粘附分子，或另外-这种有机体性可以通过（i）EV注射部位，（ii）血流特征，（iii）EV逃避非特异性清除的能力或（iv）渗透性来解释。大部分器官仍然形成的斑马鱼胚胎的大小和透明度，使得能够实时更好地了解EV生物分布。有趣的是，体内大部分内源性释放的外泌体以及注射到斑马鱼胚胎中的预标记肿瘤EV被尾静脉丛吸收。CVP高度富集清道夫内皮细胞，使人联想到哺乳动物肝脏内的肝窦内皮细胞。此外，这个血管区域显示出较慢的血流动力学，从而促进EV停滞。利用斑马鱼模型系统的高时空分辨率，通过使用动力蛋白抑制剂和体内应用的清道夫受体的竞争性抑制剂进一步证明，这些内皮细胞的EV摄取可能是由发动蛋白中的清道夫受体介导的。值得注意的是，参与靶细胞的受体和特异性表面EV蛋白之间的相互作用可能导致信号通路的直接激活，并可能严重影响这些EV的命运。实际上，EV的子集可以通过将信号传递给位于靶细胞PM的受体来发挥其主要功能。
这些研究同样表明通过巡逻CVP血管腔中存在的巨噬细胞有效摄取EV。这种摄取可能通过丝状背斜和巨噬细胞增多症发生。受体表达的遗传干扰或其体内运输的调节可以提供对这些过程的更多洞察。最后，由于病理性EV的持续分泌水平导致的清除机制的破坏或饱和可能扩大靶细胞的范围，从而“改变”这些EV的病理作用。在这方面，体内EV分泌水平的生理或病理水平的近似可能证明对于真正理解它们的重要性是关键的。因此，斑马鱼中高分辨率的实时成像可以帮助进一步解释EV随时间的细胞类型特异性靶向，以及它们在PM和所涉及的受体上的停留时间的细节。此外，它将允许详细分析它们在体内亚细胞水平的摄取和运输。
命运：退化，反向融合和消息传递
内化后，EVs遵循三种可能的命运：（i）运输至溶酶体-导致其内容物退化/再循环; （ii）EV与后内体的限制性膜的反向融合-导致EV货物递送至细胞质和/或将外来体跨膜蛋白整合到宿主细胞膜中; （iii）EV的分泌。或者，EVs可以与接收PM融合以运送货物，但大多数报告表明货物运输前的吸收。由于目标细胞中EV的命运将直接影响其功能，因此与EM结合的实时成像可以成为进一步破译EV生理学这一方面的有力工具。通过使用标记有pH敏感和非pH敏感标记物组合的EV标记物与pH敏感性组合，体内成像可用于证明向晚期内体区室的运输。有趣的是，最近使用13C标记的同位素标记的报告表明，被溶酶体降解的EV货物可以被细胞重新利用。在斑马鱼胚胎发育的背景下，CVP的内皮细胞对YSL衍生的内源性EV的摄取和溶酶体降解显示提供营养支持。即便如此，通过EV的降解，向溶酶体区室的运输可能并不仅仅与营养支持有关。使用相关光学和CLEM证实了巡回巨噬细胞的晚期内体/溶酶体内化EV的积累。这种方法可以在斑马鱼中有效地进行，从而解锁与功能性货物转移到接收细胞有关的一些剩余秘密。尽管它们被分选到溶酶体区室，肿瘤EV确实可以诱导巨噬细胞活化，这表明EV信息/内容的转移可能在该过程的某个步骤发生。同样，在不久的将来，通过跟踪EV摄取和调节后接收细胞的表型变化，可以直接在斑马鱼中评估EV的功能影响，扩展到其他生物学问题。
结论
尽管最近取得了重大进展，但外泌体和其他体内EV的确切相关性仍然模糊不清。此外，虽然病理学，特别是癌症，被广泛研究，但正常生理学中EV的确切功能仍然难以捉摸。解决这些问题需要模型系统，允许高分辨率动态观察EV释放，运输和摄取，以及调整EV释放和定位的工具。啮齿动物模型还没有适应这样的任务，无脊椎动物模型，尽管有其他优点，大多缺乏类似于人类的循环系统。相比之下，斑马鱼胚胎具有许多优势，包括快速发育，低成本，基因改造的适应性和自然透明度-允许非侵入性成像-和血管网络。通过将高速体内显微镜与EM分析相结合，他们成功地允许以高时空分辨率探测单个EV。与高时空分辨率成像兼容的体内方法，现在可以在斑马鱼胚胎中使用，将有助于解开EVs的旅程和功能的基本方面。
