Nat Biotech综述 | 基因编辑在免疫细胞治疗中的应用
撰文 | 章台柳
责编 | 兮
基因编辑的免疫细胞已经作为“活体药物”用于血液肿瘤的治疗。基因编辑细胞的首个成功案例就是利用病毒载体插入CAR（chimeric antigen receptor），使自体T细胞获得靶向肿瘤抗原的特异性。CAR-T细胞成功的临床案例证明在体外进行基因修饰是安全可实现的，且具有显著的持久的抗肿瘤效果。CAR-T在治疗血液肿瘤上效果显著，靶向CD19的CAR-T用于治疗复发难治性急性淋巴细胞白血病，缓解效率达到80%。为了扩展CAR-T在其他疾病的使用，研究人员在靶向抗原、与小分子药物等传统治疗方法的联合、下一代CAR的开发等方面进行积极探索。
2019年6月3日，来自哈佛医学院和麻省综合医院的Stefanie R. Bailey和Marcela V. Maus在Nature biotechnology杂志上发表综述文章Gene editing forimmune cell therapies，详细讨论了基于免疫细胞（包括T、NK、单核细胞）、造血干细胞HSCs、诱导多能干细胞开发的细胞疗法中目前使用的合成生物学和基因编辑的策略及未来发展方向；探讨了细胞治疗在肿瘤、免疫耐受、感染性疾病和再生医学中的潜在利用价值。
目前免疫细胞的基因编辑大多聚焦于T细胞，主要基于天然TCRs和抗体-T细胞信号结构域融合成CAR两种方式，靶向肿瘤抗原。抗原受体天然以TCRs和抗体两种形式存在。TCRs表达于T细胞中，识别主要组织相容性复合体MHC所递呈的多肽，使得T细胞能够靶向胞质蛋白。TCR-T细胞的靶标主要针对自身谱系抗原（self-derived-lineage antigens），如黑色素瘤的MART-1（melanoma antigen recognized by T cells 1）、结直肠癌的CEA（carcinoembryonic antigen），癌症-睾丸抗原中的NY-ESO-1。遗憾的是，目前仅有NY-ESO-1 TCR-T能够很好的耐受，MART-1 TCR对眼睛、耳朵、皮肤产生on-target毒性，CEA TCR对结肠产生on-target毒性。在上皮癌、结直肠癌、乳腺癌的临床试验中发现具有识别突变抗原（neoepitopes）TCR的TIL具有治疗癌症的潜在价值，但是肿瘤逃逸依然存在。使用靶向KRAS G12D的TIL（tumor-infiltrating T lymphocytes）治疗转移性肺癌患者【1】，开始肿瘤进展得到控制，随后一例患者的肿瘤细胞通过丢失编码HLA的等位基因进行逃逸。美国国家癌症中心最近开展了鉴定并使用neoantigen特异的TCRs治疗多种实体瘤的临床试验（NCT03412877）。突变特异性TCRs治疗或将成为最终的个性化肿瘤特异性免疫治疗。但是每个病人的肿瘤突变具有独特性，寻找个性化TILs，测序并克隆TCRs，转染T细胞，整个过程目前不能自动化操作，依赖于专家个人的经验，时间和费用将是TCR-T推广和量产所面临的最大挑战。
传统的CARs融合抗体的可变区和TCR信号分子，第二代CARs增加了共刺激分子的胞内段，提高T细胞激活效率。与TCRs不同，CARs识别抗原不依赖于MHC，这也限制CARs只能识别细胞表面分子。CD19在正常B细胞表面很少表达，但普遍表达于B细胞恶性肿瘤，是CAR-T的理想靶标。CD19-CAR-T在临床取得显著的治疗效果，对复发性或难治性急性淋巴细胞白血病的缓解超过80%，被FDA批准用于治疗难治性B细胞白血病和淋巴瘤【2,3】。靶向BCMA（B cell maturation antigen）的CAR-T用于治疗多发性骨髓瘤也正在开展临床试验。靶向其他抗原的CAR-T正在研发中，比如CD20（B细胞）、CS1（SLAMF7，浆细胞）、CD5（T细胞）、CD37（T和B细胞）等。但是所有的靶点都是谱系特异的，而不是肿瘤特异的，这就导致清除肿瘤细胞的同时，也清除一些必需的血液细胞；例如CD33 CAR-T用于治疗髓系白血病时，必需的成熟粒细胞也被清除，可以利用基因编辑技术在自体HSC中敲除CD33后移植治疗，以恢复正常的髓系细胞谱系。缺乏肿瘤特异性表面抗原限制CAR-T技术用于实体瘤治疗。在肿瘤细胞上过表达的抗原如mesothelin和Her2，在正常组织中也有表达，这就会导致on-target毒性。少数严格限制在肿瘤中表达的抗原如胶质母细胞瘤表达的EGFRvIII，则存在异质性表达，限制了CAR-T的使用。
为了扩展CAR-T的治疗领域，研究人员在CAR的设计上有众多创新之举。为了提高T细胞对肿瘤细胞杀伤的特异性，采取双受体模式。Fedorov等设计了识别肿瘤抗原CAR，同时表达抑制性CAR，PD-1或CTLA-4，抑制CAR-T对正常组织的杀伤作用。Lim等的方案是抗原A的识别驱动靶向抗原B的CAR转录表达。为了解决肿瘤下调抗原或抗原表达抑制性导致的肿瘤逃逸，采用separate transduction、co-tranduction或者tandem CAR等技术同时靶向多个抗原或许是新的方向。目前20项临床试验正在开展以检测同时靶向CD19/CD20及CD19/CD22的治疗效果。肿瘤抑制性微环境是CAR-T应用于实体瘤的一大挑战，编辑CAR-T使之能分泌anti-PD-L1、敲除PD-1的表达、IL-4-IL-7将IL-4抑制信号转变成IL-7激活信号等或许能克服肿瘤抑制性作用。
目前在T细胞中表达CAR主要基于逆转录病毒和慢病毒转导系统，但其转基因的载量有限，随着转基因数目增加，病毒的滴度及转导效率都减弱。为了克服这些问题，一些非病毒的基因编辑技术发展起来，如使用转座子技术的Sleeping Beauty和piggyBac。使用Sleeping Beauty编辑的CD19+ CAR-T联合自体或异体HSC移植达到总生存率100%及63%的治疗效果。不过转座子体系使用大量的DNA用于转染，导致细胞活性下降，基因表达水平不高。病毒转导体系存在另一问题是整合位点，逆转录病毒倾向整合到造血细胞的LMO基因位点，导致白血病的发生。整合位点会影响治疗效果，一名患者经整合到TET2基因的CD19-CAR-T治疗后，获得疾病的完全缓解。临床前研究表明，使用TALENs（transcription activator–like effector nucleases）、homing ednonucleases、CRISPR-Cas9等技术将CAR特异性整合到特定的基因位点（如内源TCR）不仅仅提高抗肿瘤治疗效果，而且有助于“off-the-shelf”商品化CAR-T的生产。
基因编辑技术不仅应用于T细胞，在NK、巨噬细胞、造血干细胞和非造血干细胞中都有探索。NK细胞具有细胞溶解功能，抗病毒、抗肿瘤作用，因为缺乏导致GvHD（移植物抗宿主病）的TCR，更易制成“off-the-shelf”商品。临床的前期数据表明商品化的CD19 CAR NK细胞治疗B细胞恶性肿瘤具有安全性和有效性【4】。但是NK细胞转染效率低、需要高浓度IL-2或者IL-15支持存活等特点是基因编辑NK细胞的困难之处。使用基因编辑技术，改变巨噬细胞在肿瘤微环境中的抑制性作用主要通过以下途径：分泌辅助T、NK的细胞因子如IL-21；下调抑制性基因IL-10和PD-L1的表达；降低‘don’t eat me’受体SIRP-α的表达，增强吞噬作用。诱导多能干细胞（iPSCs）和造血干细胞（HSCs）可以用来产生携带肿瘤特异性TCR或CAR的T细胞。产生的T细胞具有自我更新能力，能够增强细胞的持久性，延长疗效。但其副作用事件不得不考虑，除了CAR靶向相关的B细胞再生障碍性贫血及细胞因子释放综合症，还有大量细胞分裂导致的基因组潜在改变及iPSCs不分化导致的细胞水平毒性。使用基因编辑技术改造非造血干细胞如NSCs（neural stem cells）和MSCs（mesenchymal stem cells），可以实现释放有害于肿瘤生长的酶类、搭载前药系统、递送纳米颗粒药物、递送抗肿瘤物质如IFN、递送溶瘤病毒等功能，抑制肿瘤生长。
基因编辑的免疫细胞不仅在抗肿瘤免疫中发挥重要作用，而且具有应用于感染性疾病、移植排斥、自身免疫性疾病的潜在价值。例如编辑Treg细胞中表达TCR或CAR，或者表达免疫抑制性细胞因子如IL-10，抑制免疫反应，提高机体耐受。T细胞中表达抗自体抗体的CAR，直接杀伤自体反应B细胞，缓解自身免疫疾病。靶向CD4的CAR-T及基因编辑失活CCR5的T细胞不但干扰HIV的感染过程，而且杀伤HIV感染的细胞。目前一项利用基因编辑CAR+C34– CXCR4+CCR5+ T细胞治疗HIV的临床试验正在开展。
总的来说，CD19-CAR-T在临床上显著的抗肿瘤效果促进免疫细胞编辑领域的快速发展，也推动CAR的设计和递送系统领域的创新。在NK、巨噬细胞、干细胞等不同种类中的编辑更是将免疫细胞治疗从抗肿瘤免疫扩展到感染性疾病、自身免疫病的治疗。使用基因编辑技术改造免疫细胞具有非常可观的应用前景。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41587-019-0137-8
制版人：小娴子
参考文献
1. Tran, E. et al.T-Cell Transfer Therapy Targeting Mutant KRAS in Cancer. N. Engl. J. Med. 375,2255-2262, doi:10.1056/NEJMoa1609279 (2016).
2. Maude, S. L. et al. Tisagenlecleucel inChildren and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.N. Engl. J. Med. 378,439-448, doi:10.1056/NEJMoa1709866 (2018).
3. Schuster, S. J. et al. Tisagenlecleucelin Adult Relapsed or Refractory Diffuse Large B-Cell Lymphoma. N. Engl. J. Med.380, 45-56, doi:10.1056/NEJMoa1804980 (2019).
4. Liu, E. et al. Cord blood NK cellsengineered to express IL-15 and a CD19-targeted CAR show long-term persistenceand potent antitumor activity. Leukemia 32, 520-531, doi:10.1038/leu.2017.226(2018).
