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斑马鱼基因敲降思路


 基因敲降项目的一般工作思路:

1)首先分析目标基因在斑马鱼胚胎发育早期是否有表达(如果没有表达,则根本不存在敲降问题)。
2)设计并安排实验(RT-PCR)检测目标基因在胚胎发育早期的表达情况(目的在于确认目标基因在胚胎发育早期有表达,同时在有表达的情况下建立检测目标基因表达下调的检测方法)。实际上,即使数据库中有描述该基因在胚胎发育早期有表达,也要开展此项实验。
3)在确认该基因在胚胎发育早期有表达的情况下,再设计MO,然后订购MO(阻断翻译型MO-ATG和/或阻断原始mRNA剪接型MO-S)。在胚胎注射MO-S以验证MO-S是否能有效阻断目标基因原始mRNA的剪接(请注意,斑马鱼领域内的专家已经达成MO-ATG不再要求验证其活性。实际上是源于MO-ATG无法进行活性验证,故而我们推荐使用CRISPRi策略从抑制目标基因转录的水平上建立基因敲降的方法)。