一、基因敲降的前期准备工作相同

1.1 生物信息学分析目标基因在斑马鱼早期胚胎发送过程中是否有表达。

1.2 收集斑马鱼早期发育胚胎（通常为 48 hpf 前的胚胎），提取总 RNA，然后进行体外转录（RT）。

1.3 设计检测目标基因表达的 PCR 引物，以 1.2 获得的 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增，确认目标基因在早期有表达。

二、MO 法与 CRISPRi 法的敲降原理不同

2.1 MO 是在转录后水平上敲降基因的功能（MO-Spl 阻遏原始转录本的剪接，MO-Atg 阻遏成熟转录本的翻译）（基因转录后调控）

2.2 CRISPRi 是在转录水平上敲降基因的功能（抑制基因的转录）(基因转录水平的调控）。

 

三、敲降工具有效性验证的方法不同

3.1 吗啡啉敲降法（确认有效性）的技术路线

抑制翻译的 MO（MO-Atg）和抑制剪接的 MO（MO-Spl）二者敲降基因的有效性评价方法不同。抑制剪接的 MO（MO-Spl）的有效性评价方法是通过 RT-PCR 直接检测原始mRNA转录本的正常剪接是否被改变；抑制翻译的 MO（MO-Atg）的有效性评价通常需要通过蛋白质印迹法进行检测。但是，由于适用于斑马鱼的抗体很少，过去一般通过报告基因法来进行有效性评价（参见我们发表的论文 Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )， 但后来斑马鱼领域给出的 MO 使用指南（见已发表的研究论文：Stainier et al., 2017. Plos Genetics, 13(10): e1007000）指出这种报告基因评价法缺乏特异性，因而不再推荐该报告基因评价方法。也正是由于没有相应比较方便的评价方法，一般不推荐此种抑制翻译（MO-Atg）   的 MO 敲降法。确认抑制剪接的 MO（MO-Spl）敲降基因有效性的技术路线如下：

3.1.1 分析斑马鱼目标基因的基因组组成（外显子-内含子结构），然后针对该基因，设计阻  遏原始转录本剪接的吗啡啉（morpholino）（MO-Spl）。

注：MO-spl 不能阻止母源转录本的翻译，如果要阻止母源转录本的翻译，需要设计阻遏原始转录本翻译的吗啡啉（MO-Atg）。

3.1.2 订购吗啡啉 MO-Spl 或 MO-Atg 和标准对照 MO。

3.1.3 将不同浓度的 MO-Spl 注射入斑马鱼受精卵（标准对照 MO 仅注射最高浓度）

3.1.4 待注射胚胎发育至特定时期（优选 48 hpf 前的某些时期），收集胚胎，提取总 RNA， 然后进行体外转录（RT）。

3.1.5 按 1.3 已建立的方法进行 RT-PCR 扩增，确认目标基因的原始转录本的正常剪接是否被阻遏（发生异常剪接）。同时，设置检测管家基因表达作为内参对照，确认整个 RT-PCR 过程正常。

注：如果是使用 MO-Atg，则无简单易行的有效性检测方法（一般不做有效性检测，仅开展特异性检测）。

3.1.6 分析 3.1.5 的实验结果，确定 MO 敲降工具的有效性，以及实现有效敲降的最低注射浓度。

3.2 CRISPRi 敲降法（确认有效性）的技术路线

 

CRISPRi 敲降的有效性可以通过RT-PCR 法检测目标基因表达水平是否被有效下调来进行直接评价。一般使用普通半定量 RT-PCR 即可，确有需要，可以考虑定量 RT-PCR 法确认敲降程度。

3.2.1 分析目标基因的基因组结构，确定目标基因转录起始位点和/或 5’UTR 位置。 根据目标基因的转录起始位点的特征，设计 sgRNA 识别位点---CRISRP 序列的设计（不少于 4 个）。

3.2.2 体外合成至少 4 条不同的 sgRNA（每基因）和 dCas9-Eve mRNA。

3.2.3 将 4 条 sgRNA 按不同浓度和 dCas9-Eve mRNA 混合后共同注射斑马鱼受精卵。同时以相同浓度的 dCas9-Eve mRNA 注射受精卵作为空白对照。

3.2.4 待注射胚胎发育至特定时期（优选 48 hpf 前的某些时期），收集胚胎，提取总 RNA， 然后进行体外转录（RT）。

3.2.5 按 1.3 已建立的方法进行 PCR 扩增，确认目标基因的表达水平是否被有效抑制（阻遏转录）。同时，设置检测管家基因表达作为内参对照，确认整个 RT-PCR 过程正常。

3.1.6 分析 3.2.5 的实验结果，确定 CRISPRi 敲降工具的有效性，以及实现有效敲降的最低注射浓度。

四、CRISPRi 敲降方法的特异性优于 MO 法的特异性

基因敲降方法的特异性需要通过表型拯救的方法来回答。之所以需要表型拯救，是因为需要排除基因敲降的表型是由于敲降工具的脱靶或者敲降试剂本身的毒性而导致的非特异   表型，换句话说，要排除敲降表型是源于基因敲降工具的脱靶或者试剂本身的毒性所造成的   这种可能。拯救的基本实验策略是：在基因敲降的基础上，过表达被敲降的基因（通常是同时显微  注射目标基因的戴帽 mRNA），然后观测原来出现的表型是否被恢复（或有所恢复）至正常（参见我们发表的论文 Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )。如果基因敲降的表型在过表达目标基因的 mRNA 后有很好的拯救，那么可以确认敲降方法是特异的。基于基因组编辑技术的 CRISPRi 敲降方法，一般同时注射 4 个 sgRNA + dCas9-Eve mRNA。先前的很多研究已经发现，单个 sgRNA 引导 dCas9-Eve 所发挥的抑制基因表达的功能远没有多个 sgRNA 同时引导 dCas9-Eve 发挥的抑制功能强（参见我们发表的论文 Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )，这种多个 sgRNA 的协同作用决定了CRISPRi法脱靶作用可以忽略，而 RNA 本身的毒副作用是完全可以进行对照的（使用一组仅注射dCas9-Eve mRNA 作为对照）。相对而言，MO 的脱靶效应要大很多。事实上，有实验证据表明：即使有多达 5 bp 的错配，MO 也会发生作用。而对于一个 25 nt 长的 MO 而言，5 bp 错配在基因组中的类似序列可以是成白上千。因此，MO 敲降的脱靶机会很大。

另外，有研究报道注射 MO 可异常激活斑马鱼 p53 基因的表达，非特异性地诱导胚胎细胞凋亡，因此，在很多情况下，如果使用 MO 作基因敲降，是需要同时注射敲降 p53 基因的MO 以抑制过表达的p53（请参考已发表的文献 Robu et al., 2007. PLoS Genet. 3(5):e78）。

再者，如果 MO 自身就存在毒性（源于序列本身或者化学合成过程），则是无法进行对照的。MO 方法刚发明不久，就有研究指出即使是同一种序列，不同批次合成的产品的毒性也可能是不一样的，显然，这种“内在”的毒性是无法进行对照的。

 

五、CRISPRi 敲降工具（RNA 形式）供货周期远短于 MO 敲降工具

由于 MO 工具需要在美国合成，受进口手续、海关通关等的影响，到货时间一般不少于 30 个工作日。而 CRISPRi 敲降工具（RNA 形式）完全有本公司自主生产（已申请国家发明专利，专利申请号：201610843834.8），不超过 20 个工作日（一般为 10 个工作日）即可制作好，干冰寄送（到货）。