斑马鱼基因功能研究-基因敲降

一般推荐MO + CRISPRi 两种策略去同时敲降一个基因，由于MO是在转录后水平上敲降基因的功能，而CRISPRi 是在转录水平上敲降基因的功能，使用两种独立的、原理完全不同的敲降方法，如果给出的敲降效果（表型）是一样的，那么这样建立的敲降方法可以被认可是有效且特异的。请大家注意：评价基因敲降效果需要从有效和特异两个方面来考虑。有效性问题：CRISPRi敲降的有效性可以通过RT-PCR法检测目标基因表达水平是否被有效下调来进行直接评价，而MO敲降的有效性，抑制翻译的MO和抑制剪接的MO的评价方法不同。抑制剪接的MO的有效性可以通过RT-PCR直接检测看原始mRNA的剪接是否被改变而确定；抑制翻译的MO的有效性评价通常需要通过蛋白质印迹法进行检测---但是由于适用于斑马鱼的抗体很少，过去一般通过报告基因法来解决，但17年后来发表的Plos Genetics论文认为这种报告基因评价法缺乏特异性，因而不再推荐该报告基因评价方法。也正是由于没有相应比较方便的评价方法，我们一般不推荐此抑制翻译的MO敲降法。敲降策略的特异性则需要通过拯救的方法来回答。之所以需要拯救，是因为进行基因敲降时可能由于敲降工具的脱靶或者敲降试剂本身的毒性导致敲降后看到的表型是非特异的（或者说表型是源于基因敲降工具的脱靶或者试剂本身的毒性所造成的）。拯救的基本实验策略是：在基因敲降的基础上，过表达被敲降的基因（通常是同时显微注射目标基因的戴帽mRNA），然后观测原来出现的表型是否被恢复（或有所恢复）至正常(参见我们发表的论文Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )。如果有很好的拯救，那么可以确认，敲降方法是特异的。我们现在所主推的基于基因组编辑技术的CRISPRi敲降方法，一般同时注射4个sgRNA + dCas9-Eve mRNA。先前的很多研究已经发现，单个sgRNA引导dCas9-Eve所发挥的抑制基因表达的功能远没有多个sgRNA同时引导dCas9-Eve发挥的抑制功能强，这种多个sgRNA的协同作用决定了CRISPRi法脱靶作用可以忽略，而RNA本身的毒副作用是完全可以进行对照的（大家应该注意到，我们在进行敲降实验时，有一组仅注射dCas9-Eve mRNA的对照）。而相对而言，MO的脱靶作用比较大，事实上，有实验证据表明：即使有多达5 bp的错配，MO也会发生作用。而对于一个25 nt长的MO而言，5 bp错配在基因组涉及的类似序列可以是成百上千。除此以外，MO自身的毒性是无法进行对照的（即使是同一种序列，不同批次合成的产品的毒性也可能是不一样的，显然，这种“内在”的毒性是无法进行对照的）。这也在某种程度上可以解释为什么基因敲降与基因敲除的表型常常是不一样的（参考我们发表的论文Li et al., J Biol Chem. 290(16):10216-28.）。虽然2015年的Science论文后来指出基因敲除与基因敲降后表型不一致的原因可能源于基因功能冗余和/或基因功能补偿，但MO的有效性和特异性毫无疑问依然可能扮演着非常重要角色。因此，对于重要的基因（如果客户期望要长期或重点研究），一般建议还是要制备一个基因敲除突变体鱼系