一步法试剂（YSY Buffer）用于单个斑马鱼胚胎的基因型鉴定

1、斑马鱼早期发育胚胎的收集

收集发育至4-、8-、16-、32-、64-、128-、256-、512-、1K-、和4K-细胞期、以及50%外包期和75%外包期等不同发育时期的胚胎各3枚置于0.2 ml的PCR管中。尽可能吸去胚胎中的水溶液，然后将胚胎置于冰盒中备用。【适用于经胚胎整体原位杂交后的单个胚胎的基因型鉴定】。

2、单个胚胎基因组DNA模板的制备

在盛有单个胚胎的PCR管中加入3.0 ml的YSY Buffer，快速离心确保溶液和胚胎均位于PCR管底，然后放入PCR仪中执行60℃ 30 min、95℃ 10 min、16℃ 1 min的基因组DNA模板制备程序。

3、467bp的vps28基因组片段的直接扩增

按常规方法配制PCR反应液（每胚胎30 μl扩增体系）27 μl含15 μl 2 × PCR Master mix、1.2 μl正向引物(引物序列为: GCCCTAGCTGGATATTTCAC；5 μM)、1.2 μl反向引物(引物序列为: CCCACCCTGAACTAAATGCA；5 μM)、9.6 μl超纯水，混匀，快速离心。将配制好的27 μl PCR反应液直接加入前述制备好的单个胚胎基因组DNA模板的PCR管中，快速离心后，放入PCR仪中，执行如下DNA扩增程序：95 ℃ 3 min、30 × (95 ℃ 15 sec, 58 ℃ 15sec, 72 ℃ 15 sec)、72 ℃ 5 min。

4、凝胶电泳观测

制备1.5%的琼脂糖凝胶（含0.5 μg/ml 溴化乙锭），以移液枪吸取5 μl PCR反应产物加入样品孔中进行常规电泳（电压200 V，电泳15 min）。电泳结束后，在凝胶成像仪中观测并拍照记录。

图一、单个斑马鱼发育早期胚胎vps28基因的467 bp基因组DNA片段的扩增结果。64-细胞期的单个胚胎中可微弱的基因组DNA扩增信号，自256-细胞期的单个胚胎则可见明显扩增产物，自4K-细胞期的单个胚胎的467 bp基因组DNA片段扩增条带则清晰明亮。