1、Q:请教老师，我设计的sgRNA 与非靶序列相似度多大时会把这个非靶标基因也编辑了？是否可以理解为：在远离pam端有4个及以内的与靶序列不同碱基的序列都是可以被编辑的。即脱靶到了那些序列。

A:有脱靶机会，但通常识别活性会比较低，一般地，脱靶是需要尽量避免的。如果想要敲除两个以上基因，需要针对要敲除的基因分别设计crispr以制备不同的sgRNA。

Q:crispr/Cas13在gRNA设计上有什么要注意的吗？是否可以保留cas9所用的80bp骨架只更换gRNA？

A:Cas13的sgRNA与cas9的完全不同，不能使用cas9对应的sgRNA骨架。

Q:sgRNA的骨架与靶点CRISPR的结合紧密程度是否会影响打靶的效率？

A:sgRNA的骨架序列并不与crispr（基因组上的特定DNA序列）结合，识别crispr序列的是102nt（20+82 nt）sgRNA中的前20 nt（gRNA序列），通过gRNA与crispr序列的互补识别，sgRNA引导Cas9靶向切割crsipr中3'侧（靠近PAM即NGG）的3至4 nt间的3‘-5’磷酸二酯键，形成双链断裂（DSB）。

Q:请问我设计人基因的sgRNA的时候，发现保守结构域所在的外显子很少有比较高得分的，甚至说很低，请问这种情况应该怎么办?

A:crispr评分问题，绿色没有问题，黄色勉强能用，红色不能用（估计是在基因组中有相同序列，1个sgRNA将识别多于1个靶向位点，脱靶问题验严重），实在为难的话，可crispr设计的区域提前到前一个外显子。另外，建议使用CCTOP软件设计crispr

Q:我们也在使用CCTOP这个软件，但是发现有时排名靠前的却评分为中等或低，不知道如何选择。

A:评分的高低只是参考，medium应该是不错的。那个评分是来自一篇研究论文，如果阅读原文，你会发现数据的样本量不是太大，且相关系数不是太大。所以效率评分仅作参考。选择crispr时，不能在基因组中存在明显的脱靶位置的序列。

Q:那么CCTOP选择是优先考虑排名是吗？例如从T1-T2-T3...

A:还是优选那些脱靶机会低的crispr，（看候选脱靶序列的相似性，尽可能选那些候选脱靶序列具3个mismatch的，然后在按效率的高低选。

Q:如果做RT-PCR验证，引物是不是需要特异性针对设计sgRNA对应的转录本？

A:是的，需要将靶向突变位置的cDNA扩增出来，注意，由于担心基因组上基因组序列的改变可能会影响原始mRNA的剪接，因此，设计引物时，最好是在目标序列的前面和后面的外显子上分别设计正反向引物。

Q:我做了一个CRISPR的基因敲除，目前在挑单克隆时送测了24个，亚克隆的情况多数出现两组峰：一组是非移码突变的，一组是有突变的（插入一个碱基或者突变成其它氨基酸），请问这种情况是我克隆没挑够还是基因本身的生理原因造成的啊？

A:单克隆测序应该不会出现“两组峰”！你是将细胞克隆的基因组DNA的PCR产物直接送测序？还是将其亚克隆后再挑选阳性转化子去测序的？如果是后者，你是否想说你的阳性转化子克隆测序结果表明：一组（若干个克隆）为非移码突变，一组（24个克隆中的另外一些克隆）是有突变的（插入一个碱基）？

Q:是的，是亚克隆测序，一组为非移码突变，一组为突变。我送了十个单克隆出去测TA都是这个样子，我想说，能不能把之前的sgRNA的病毒再感染一下这些单克隆，可否拿到双枪的结果？

A: 你首先需要确认原先的sgRNA识别的序列在候选细胞克隆的基因组序列中是否已被突变？如果已经突变了，则sgRNA无法再次发挥左右（一般地，如果已经发生突变即使是非移码突变，其crispr序列应该已经突变）。

Q:我想请问下sgRNA设计中，有些网站把PAM序列也弄到sgRNA里了，有些网站又没有，那我们设计sgRNA的时候需要把PAM也加进去吗？

A:常用CRISPR设计软件

1、http://crispr.mit.edu

2、http://crispr.cos.uniheidelberg.de/index.html

3、http://crispor.tefor.net/

4、http://www.rgenome.net/cas-designer/

5、http://zifit.partners.org/ZiFiT/

这里需要区别两个名词：CRISPR vs sgRNA；一些文献常将这两个词混用（我们最初的培训讲义也是混用的）。实际上，sgRNA是RNA形式的分子。在基因组编辑中，sgRNA引导Cas9靶向识别CRISPR序列，其中的PAM（CRISPR序列临近的3个核苷酸NGG为PAM）作为CRISPR序列在基因组上的一个标记，对于靶向识别至关重要，靶向识别的结果是Cas9的两个核酸内切酶结构域(两把”分子剪刀“)将PAM前的3-4核苷酸间的3'-5’磷酸二酯键切断，造成DSB（双链断裂）。DSB出现后，诱发细胞针对该DSB进行NHEJ或HR修复，产生不同编辑子。筛选不同的编辑子，有希望获得KO或KI的等位基因。从上述描述可以看出，CRISPR序列是一个DNA序列（不包括PAM），而由此合成的sgRNA则是用来识别该DNA序列的。张锋把CRISPR + PAM 序列称作Guide 序列，我们在讲课中使用这一说法。在使用软件设计CRISPR序列时，需要将目标DNA序列（包括假定的PAM序列）都输入，如果没有PAM，就不可能设计出CRISPR序列。

Q:那还有一个问题老师，我想请问下软件里设计的sgRNA会不会有的是反义链上的序列呢，如果有的话我们需要把它互补配对回来再加CACC(g)吗？是否只需要直接在给出的序列前面加CACC（g)就行？

A:加什么序列取决于你使用的驱动sgRNA表达的空载体中启动子的序列，CACC应该是人U6启动子的最后4个核苷酸序列。

Q:用T7启动子资料说转录起始位点是G或A ，但是ZiFiT网站是GG，是不是三个都可以，要是20个核苷酸的CRISPR序列首位不是这三个G, A或者GG, 自己手动添加到里面是不是也可以？

A:CRISPR序列一般以G开头，这是由于转录自嘌呤（主要是G，有时为A)开始（是为转录起始位点）。如果crispr（20nt）序列的前2 nt是GG，在以T7启动子（前17 nt)为驱动的体外转录中，当然是最好，如果crispr（20 nt)不是以G开头，可以加1-2个G（一般加1个G即可），多了1-2G的sgRNA被证明不影响引导常用Cas9（spCas9）识别crispr序列的活性，但不能有效引导espCas9（保真版Cas9）识别crispr序列。

Q:如果U6启动子启动转录多了一部分序列会对sgRNA的转录及效率产生影响吗？就是：U6+一小段序列+BbsI-sgRNA-BbsI这样的设计，这一小段序列对整个结构的影响很大吗？

A:转录本身可能没有什么问题，但转录产物不是你原来设计的sgRNA。最近有报道说多出来几个nt可能对引导spCas9识别crispr序列影响不大，但是你提出的这种设计方式显然不是推荐的方式，其结果是很可能不能获得你期待的基因组编辑作用。

Q:看测序结果的时候我们应该看哪里，理想中的是在设计的三个sgRNA的位点出突变吗？还是在某个sgRNA附近突变也可以。

A:DSB一般出现在PAM前的3-4bp之间。NHEJ修复在此发生，因此，Indel突变（插入缺失突变）主要发生在位置的附近，当然也会有较大（甚至更大）片段删除的情况出现。每个crispr位置都可能出现突变（如果对应的sgRNA都有活性的话）。但当有活性的sgRNA同时出现时，造成大片段删除的机会大增。在这种情况下，常常仍能发现indel突变发生在每个crispr位置上的痕迹（即突变主要出现在PAM前的3-4bp附近）。