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基于sgRNA的相关问题讨论


1、Q:请教老师,我设计的sgRNA 与非靶序列相似度多大时会把这个非靶标基因也编辑了?是否可以理解为:在远离pam端有4个及以内的与靶序列不同碱基的序列都是可以被编辑的。即脱靶到了那些序列。

A:有脱靶机会,但通常识别活性会比较低,一般地,脱靶是需要尽量避免的。如果想要敲除两个以上基因,需要针对要敲除的基因分别设计crispr以制备不同的sgRNA 

2.

Q:crispr/Cas13gRNA设计上有什么要注意的吗?是否可以保留cas9所用的80bp骨架只更换gRNA

A:Cas13sgRNAcas9的完全不同,不能使用cas9对应的sgRNA骨架。

3.

Q:sgRNA的骨架与靶点CRISPR的结合紧密程度是否会影响打靶的效率?

A:sgRNA的骨架序列并不与crispr(基因组上的特定DNA序列)结合,识别crispr序列的是102nt20+82 ntsgRNA中的前20 ntgRNA序列),通过gRNAcrispr序列的互补识别,sgRNA引导Cas9靶向切割crsipr3'侧(靠近PAMNGG)的34 nt间的3-5’磷酸二酯键,形成双链断裂(DSB)。

4.

Q:请问我设计人基因的sgRNA的时候,发现保守结构域所在的外显子很少有比较高得分的,甚至说很低,请问这种情况应该怎么办?

A:crispr评分问题,绿色没有问题,黄色勉强能用,红色不能用(估计是在基因组中有相同序列,1sgRNA将识别多于1个靶向位点,脱靶问题验严重),实在为难的话,可crispr设计的区域提前到前一个外显子。另外,建议使用CCTOP软件设计crispr

Q:我们也在使用CCTOP这个软件,但是发现有时排名靠前的却评分为中等或低,不知道如何选择。

A:评分的高低只是参考,medium应该是不错的。那个评分是来自一篇研究论文,如果阅读原文,你会发现数据的样本量不是太大,且相关系数不是太大。所以效率评分仅作参考。选择crispr时,不能在基因组中存在明显的脱靶位置的序列。

Q:那么CCTOP选择是优先考虑排名是吗?例如从T1-T2-T3...

A:还是优选那些脱靶机会低的crispr,(看候选脱靶序列的相似性,尽可能选那些候选脱靶序列具3mismatch的,然后在按效率的高低选。

 

5.

Q:如果做RT-PCR验证,引物是不是需要特异性针对设计sgRNA对应的转录本?

A:是的,需要将靶向突变位置的cDNA扩增出来,注意,由于担心基因组上基因组序列的改变可能会影响原始mRNA的剪接,因此,设计引物时,最好是在目标序列的前面和后面的外显子上分别设计正反向引物。

6.

Q:我做了一个CRISPR的基因敲除,目前在挑单克隆时送测了24个,亚克隆的情况多数出现两组峰:一组是非移码突变的,一组是有突变的(插入一个碱基或者突变成其它氨基酸),请问这种情况是我克隆没挑够还是基因本身的生理原因造成的啊?

A:单克隆测序应该不会出现“两组峰”!你是将细胞克隆的基因组DNAPCR产物直接送测序?还是将其亚克隆后再挑选阳性转化子去测序的?如果是后者,你是否想说你的阳性转化子克隆测序结果表明:一组(若干个克隆)为非移码突变,一组(24个克隆中的另外一些克隆)是有突变的(插入一个碱基)?

Q:是的,是亚克隆测序,一组为非移码突变,一组为突变。我送了十个单克隆出去测TA都是这个样子,我想说,能不能把之前的sgRNA的病毒再感染一下这些单克隆,可否拿到双枪的结果?

A: 你首先需要确认原先的sgRNA识别的序列在候选细胞克隆的基因组序列中是否已被突变?如果已经突变了,则sgRNA无法再次发挥左右(一般地,如果已经发生突变即使是非移码突变,其crispr序列应该已经突变)。

7.

Q:我想请问下sgRNA设计中,有些网站把PAM序列也弄到sgRNA里了,有些网站又没有,那我们设计sgRNA的时候需要把PAM也加进去吗?

A:常用CRISPR设计软件

1http://crispr.mit.edu

2http://crispr.cos.uniheidelberg.de/index.html

3http://crispor.tefor.net/

4http://www.rgenome.net/cas-designer/

5http://zifit.partners.org/ZiFiT/

这里需要区别两个名词:CRISPR vs sgRNA;一些文献常将这两个词混用(我们最初的培训讲义也是混用的)。实际上,sgRNARNA形式的分子。在基因组编辑中,sgRNA引导Cas9靶向识别CRISPR序列,其中的PAMCRISPR序列临近的3个核苷酸NGGPAM)作为CRISPR序列在基因组上的一个标记,对于靶向识别至关重要,靶向识别的结果是Cas9的两个核酸内切酶结构域(两把”分子剪刀“)PAM前的3-4核苷酸间的3'-5’磷酸二酯键切断,造成DSB(双链断裂)。DSB出现后,诱发细胞针对该DSB进行NHEJHR修复,产生不同编辑子。筛选不同的编辑子,有希望获得KOKI的等位基因。从上述描述可以看出,CRISPR序列是一个DNA序列(不包括PAM),而由此合成的sgRNA则是用来识别该DNA序列的。张锋把CRISPR + PAM 序列称作Guide 序列,我们在讲课中使用这一说法。在使用软件设计CRISPR序列时,需要将目标DNA序列(包括假定的PAM序列)都输入,如果没有PAM,就不可能设计出CRISPR序列。

Q:那还有一个问题老师,我想请问下软件里设计的sgRNA会不会有的是反义链上的序列呢,如果有的话我们需要把它互补配对回来再加CACC(g)吗?是否只需要直接在给出的序列前面加CACCg)就行?

A:加什么序列取决于你使用的驱动sgRNA表达的空载体中启动子的序列,CACC应该是人U6启动子的最后4个核苷酸序列。

 

8.

Q:T7启动子资料说转录起始位点是G,但是ZiFiT网站是GG,是不是三个都可以,要是20个核苷酸的CRISPR序列首位不是这三个G, A或者GG, 自己手动添加到里面是不是也可以?

A:CRISPR序列一般以G开头,这是由于转录自嘌呤(主要是G,有时为A)开始(是为转录起始位点)。如果crispr20nt)序列的前2 ntGG,在以T7启动子(前17 nt)为驱动的体外转录中,当然是最好,如果crispr20 nt)不是以G开头,可以加1-2G(一般加1G即可),多了1-2GsgRNA被证明不影响引导常用Cas9spCas9)识别crispr序列的活性,但不能有效引导espCas9(保真版Cas9)识别crispr序列。

9.

Q:如果U6启动子启动转录多了一部分序列会对sgRNA的转录及效率产生影响吗?就是:U6+一小段序列+BbsI-sgRNA-BbsI这样的设计,这一小段序列对整个结构的影响很大吗?

A:转录本身可能没有什么问题,但转录产物不是你原来设计的sgRNA。最近有报道说多出来几个nt可能对引导spCas9识别crispr序列影响不大,但是你提出的这种设计方式显然不是推荐的方式,其结果是很可能不能获得你期待的基因组编辑作用 。

Q:看测序结果的时候我们应该看哪里,理想中的是在设计的三个sgRNA的位点出突变吗?还是在某个sgRNA附近突变也可以。

A:DSB一般出现在PAM前的3-4bp之间。NHEJ修复在此发生,因此,Indel突变(插入缺失突变)主要发生在位置的附近,当然也会有较大(甚至更大)片段删除的情况出现。每个crispr位置都可能出现突变(如果对应的sgRNA都有活性的话)。但当有活性的sgRNA同时出现时,造成大片段删除的机会大增。在这种情况下,常常仍能发现indel突变发生在每个crispr位置上的痕迹(即突变主要出现在PAM前的3-4bp附近)。

10.

Q:一个基因上如果我同时对2sgRNA位点进行编辑,这两个sgRNA距离多远合适?是最好在同一个外显子上吗?

A:你的目的是希望敲除这个基因,还是希望制造出两个Indel突变位点?如果是前者,我们建议二者之间的距离不要超过 200 bp (越近越好)。如果是后者,则建议相距200 bp之外,越远越好。

 

 

 

 

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