冠心病也称为冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease，CHD），是由冠状动脉狭窄、供血不足引起的心肌功能障碍和（或）器质性病变[1]。目前冠心病的治疗主要为药物治疗、介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）及冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass grafting，CABG）[2]。已有研究表明，传统中药可通过促进心脏梗死区或缺血区的旁路血管新生来治疗CHD[3]。促进血管新生可改善CHD患者的心肌缺血、减缓症状发作并能改善预后，降低不良心血管事件的发生率[4-5]。因此，从传统中药中筛选发现具有促进血管再生的关键药效成分，对于CHD的防治具有重要价值。
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈等功效。现代药理学研究表明，丹参具有增加冠脉流量[6]、降低心肌兴奋性和传导性、保护心肌缺血性损伤[7]、抗氧化[8-9]、保护心血管[10]、改善肾功能[11]、抗菌消炎[12]、抗肿瘤[13]等作用。丹参的主要化学成分为脂溶性的二萜醌类、水溶性酚酸类及其他类型化合物[14]。虽然目前已有较多丹参药效成分的研究，但采用新模型、新技术探索丹参中是否存在其他潜在的抗CHD活性成分，依然具有重要价值。
斑马鱼是一种国际新兴的新型脊椎模式动物，在血管生成途径上与人类表现出高度的遗传和功能的保守性，有87%的基因片段相同[15]。斑马鱼为整体动物，可以观察到整体表型，与体外细胞模型相比，具有明显优势。血管标记荧光的转基因系的斑马鱼不用染色即可观察斑马鱼节间血管情况，使得测量血管再生结果更直观精准[16]。分子对接技术主要是研究受体与药物分子之间的结合与相互作用，通过受体独有特征，筛选可能结合的药物分子以及结合模式和亲和力，是当下计算机模拟在药物研究领域的重要辅助手段[17]。自20世纪70年代中期首次出现以来，分子对接已成为协助药物设计和发现的独特计算机模拟工具，如在大型化合物库中识别新的化学支架[18]，为药物重新定位、靶点确认、预测不良反应和其他方面进行数据分析[19]。中药组成成分复杂，通过分子对接技术可以实现活性成分的虚拟筛选，进一步提高筛选的效率，降低筛选成本，已成为新药发现的重要方法。因此，本研究应用新型模式动物斑马鱼模型和分子对接技术深入研究丹参中促血管再生作用活性的关键成分，为候选药物的发现、资源开发利用提供科学依据。
1材料
1.1药材
共收集2020—2021年不同产地的丹参药材饮片，详细信息见表1。所有样品经山东第一医科大学韩利文副研究员鉴定为唇形科植物丹参S. miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，保藏于药学与制药科学学院中药资源样品库中。
1.2药品与试剂
二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批号K1723046）购自北京芯硅谷；酪氨酸激酶抑制剂PTK787（批号M1648-04）购自AbMole公司；亚甲基蓝（批号619H022）购自北京索莱宝科技有限公司；链酶蛋白酶（批号41844523）购自美国Sigma-Aldrich公司。
1.3动物
血管标记绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼Tg（fli1a：EGFP）来自国家斑马鱼资源中心。
1.4仪器
Z-A-S5型斑马鱼养殖系统（上海海圣生物实验设备有限公司）；IX83型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；ZSA0745型体式显微镜（重庆光电仪器有限公司）；LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津）；DFY-1000型摇摆式多功能高速中药粉碎机（温州顶历医疗器械有限公司）；TDZ5型台式低速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；RE-2000A型旋转蒸发仪（郑州科泰实验设备有限公司）；DZF型真空干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）。
2方法
2.1丹参提取物的制备
不同产地的丹参样品按照相同方法进行平行提取。丹参样品用中药粉碎机粉碎为粗粉，过3号筛；称取15 g丹参样品粉末放入500 mL圆底烧瓶中，加入90%乙醇120 mL（料液比1∶8），90 ℃水浴提取，提取2次，每次1.5 h；合并2次上清液，减压浓缩，真空60 ℃干燥，即得丹参提取物。
随机选取1个提取物样本（DS01），准确称定，置10 mL量瓶中，加入80%甲醇溶解定容，配制成质量浓度为2 mg/mL的溶液。按照《中国药典》2020年版一部丹参药材含量测定项下规定，采用岛津LC-20A型高效液相色谱仪，以乙腈-0.02%磷酸水溶液为流动相，测定DS12提取物中丹酚酸B的质量分数为21.46%，丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参酮I之和为0.29%。
2.2丹参提取物的斑马鱼耐受实验
选择发育至24 h（hours post fertilization，hpf）的斑马鱼受精卵，用脱膜剂链酶蛋白酶（1 mg/mL）进行脱膜处理。随机选取1个提取物样本（DS01）进行实验。设置不同质量浓度的丹参提取物（100、200、400、600、800、1000、1500、2000 μg/mL）组和对照组（给予pH 7.1～7.4、温度26.5～28.5 ℃、电导率490～530 μS、溶解氧质量浓度5.0～7.5 mg/L的养鱼水）。于体式镜下观察，记录给药24 h后斑马鱼畸形与死亡情况，计算死亡率。
采用GraphPad Prism 9统计软件通过回归分析计算丹参提取物的最低致死质量浓度，考察斑马鱼对丹参提取物的耐受性。
2.3丹参提取物对斑马鱼促进血管生成活性的研究
将发育至24 hpf的斑马鱼受精卵用1 mg/mL的脱膜剂链酶蛋白酶进行脱膜处理，将脱膜的斑马鱼放入24孔板，每孔10条。模型组中加入0.2 μg/mL PTK787，处理组先加入0.2 μg/mL PTK787后再加入丹参提取物或单体，对照组中加入空白溶剂（0.5% DMSO）。每孔加入养鱼水保证每孔体积为2 mL。24 h后于荧光显微镜下观察斑马鱼的节间血管情况并进行拍照，用Image Pro 6软件测量血管长度，统计节间血管总长度，统计结果用GraphPad Prism 9软件进行单因素方差分析，P＜0.05表明有统计学差异。
2.4基于分子对接技术筛选丹参促血管生成的活性成分
在TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php）中以“丹参”为关键词检索丹参的化学成分，剔除没有PubChem信息的化合物，将具有PubChem CID的化合物批量导入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中获得化合物的sdf结构，构建丹参小分子库，将获得丹参小分子库导入Schrodinger分子模拟包中，利用Ligpre模块进行2D sdf分子转化为3D sdf格式，用于后期分子对接的准备。
抑癌基因VHL介导的缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）降解是调控下游血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达的重要途径。因此，在RCSB pdb数据库（https://www.rcsb.org/）中下载VHL-HIF-1α复合物的晶体结构（PDB：3ZRC），将3ZRC导入Schrodinger的Maesrto10.1进行蛋白前处理，由于3ZRC有多条同源链，选择其中1条包含活性口袋的链进行分子对接。蛋白经过protein preparation模块进行补足缺失残基以及中性化等操作，最后进行能量最小化并添加OPLS2005力场。
分子对接的活性口袋由3ZRC自带的配体进行定义，直接选中3ZRC晶体中的配体生成对接盒子，对接盒子参数选择软件默认。先进性HTVS（high through virtual screening）模式的高通量筛选，将得到的化合物再次进行SP（standard precision）模式的筛选，根据对接的结果筛选前10个结合能较高的化合物进行可视化。为了验证对接的可靠性，本研究将3ZRC自带配体抽出再对接到3ZRC中5次，计算对接结合模式的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）值以评估对接的可靠性。对接的结果分别采用Pymol 2.4.1和Ligplus进行可视化。
3结果
3.1丹参提取物在斑马鱼模型的耐受性实验结果
为了更好地观察药物对于斑马鱼的致死效应，将剂量的对数值与死亡率进行回归曲线拟合。GraphPad Prism 9软件拟合的结果（图1）显示，丹参提取物质量浓度为800 μg/mL时，斑马鱼开始出现死亡；丹参提取物质量浓度为1000 μg/mL时，斑马鱼全部死亡，但在600 μg/mL时就开始出现了斑马鱼发育异常（脊柱弯曲）的情况，表明丹参提取物已经出现了致畸作用，因此本研究中丹参提取物的耐受剂量为400 μg/mL，后续实验中质量浓度最高设为400 μg/mL。
3.2丹参提取物促进斑马鱼血管生成的剂量效应
如图2所示，PTK787处理斑马鱼后，斑马鱼节间血管生长不完整，没有闭合，与对照组相比节间血管总长度显著缩短（P＜0.01）且无畸形或死亡出现，表明血管损伤模型建立成功。随机选取1个丹参提取物（DS01）考察样品在斑马鱼模型上促进血管生成作用的量效关系。发现丹参提取物质量浓度为50 μg/mL时，斑马鱼没有明显的血管生长出现；丹参提取物质量浓度为100、150 μg/mL时，斑马鱼开始出现明显的血管生长，与模型组相比具有显著性差异（P＜0.01）。说明丹参提取物能够逆转PTK787造成的斑马鱼血管损伤，且随着丹参质量浓度的增加，促血管再生作用有增强的趋势。
3.3不同产地的丹参提取物对斑马鱼损伤血管生成的促进作用
如图3所示，不同产地的丹参提取物（150 μg/ml）均出现了不同程度的促血管生成作用，与模型组相比，均具有显著性差异（P＜0.01）。不同产地的丹参提取物表现出了不完全一致的生物活性，其中DS06样品促血管生成的活性最低，DS05样品促血管生成的活性最高。
3.4分子对接技术分析
从TCMSP数据库中总共获得143个具有PubChem信息的化合物，经过Ligpre进行处理转化成3D结构。在对接模型验证（Redocking）过程中，进行了5次对接，最终3ZRC自带的配体（PubChem ID：56684144）均对接到了活性口袋，且5次对接结合能均为−39.079 kJ/mol，RMSD值为0，对接具有非常高的可重复性，证明对接模型的可靠性。
在HTVS对接模式下由132个化合物成功对接到活性口袋，对接结合能−26.865～−2.807 kJ/mol。在SP对接模式下，总共有137个结合能小于0的化合物被成功对接，结合能为−31.091～−0.197 kJ/mol，有3个化合物的结合能大于0 kJ/mol，可能是VHL-HIF1a非抑制剂。表2为排名前10的化合物与3ZRC对接结合能及化合物信息，对接排名最高的化合物为丹酚酸B，结合能为−31.091 kJ/mol。对接结果显示，3ZRC晶体自带的共晶阳性配体（positive ligand，PL）刚好与3ZRC蛋白晶体的活性口袋契合（图4-A），具有很好的重现性。进一步分析发现，PL与活性口袋的TYR-98、HIS-110、SER-111和HIS-115 4个氨基酸残基形成氢键。图4-B为丹酚酸B与3ZRC对接的模式图，丹酚酸B主要通过PRO-99、TYR-98、ARG-107和HIS-110 4个氨基酸残基形成氢键并锚定在3ZRC的活性口袋，其中TYR-98和HIS-110 2个氨基酸残基同样出现了PL与3ZRC的对接模式中。
3.5丹酚酸B对斑马鱼损伤血管生成的促进作用
如图5所示，与模型组比较，10、20、40、80 μg/mL的丹酚酸B均具有显著的促血管生成作用（P＜0.01），且呈剂量相关性。
4讨论
斑马鱼体系现已被广泛用于药物筛选和毒理学研究[20-21]。斑马鱼胚胎和幼鱼体积很小，可用微孔培养板培养，故适合于高通量筛选[22]。斑马鱼属于脊椎动物，是一种活体研究体系，可保留药动学过程，故其与其他的体外研究体系相比更加适合用于中药这种复杂化学体系的药效学研究[23]。斑马鱼的受精卵或者鱼苗能够便利地从培养介质中吸收亲水或亲脂的物质，使得其检测中药的活性变得非常方便[24]。PTK787是一种酪氨酸激酶抑制剂，能够特异性地抑制血管内皮生长因子受体的表达，进而抑制血管生成[25]。研究表明，瓜蒌[26]、白芍[27]、天麻[28]、丹红注射液[29]等在斑马鱼模型上均体现了明显的促进血管生成的作用，可逆转PTK787诱导的血管损伤。
中药的成分非常多，理化性质复杂，在常规的细胞学筛选体系和分子筛选体系中采用中药进行新药筛选时常常难以避免非特异性影响，从而产生假阳性或假阴性结果。传统中药具有多成分、多靶点、协同作用的特点[30-31]，建立注重整体、精准识别的药效成分发现技术，一直是本领域的瓶颈环节。本研究借助计算化学的数据挖掘技术，建立了基于斑马鱼模型的“虚拟筛选-活性评价”的药效成分发现方法，使计算机模拟与实验结合，有效节约实验时间，降低实验成本，为天然药效成分的高效发现提供新思路。研究表明，VHL蛋白中pVHL是HIF-1α家族的底物识别位点，靶向HIF-1α家族进行泛素介导的蛋白酶体的降解[32-34]。在正常有氧条件下，HIF-1α通过脯氨酰羟化酶（prolyl hydroxylase，PHD）家族，在脯氨酸上被羟基化引发下游信号级联。在低氧或缺氧条件下，当PHD不能发挥功能或VHL突变时，则会改变pVHL与HIF-1α或elongin C的结合，HIF-1α不能被pVHL识别[35-37]。HIF-1α的聚集和转录会上调一些血管发育的重要基因（如促红细胞生成素、VEGF），细胞增生的基因（血小板衍生因子-β、转化生长因子-α）和糖代谢的基因（葡萄糖转运蛋白-1）[38]。本研究发现，丹参中丹酚酸B与VHL-HIF-1α复合物具有较高的对接性能，提示丹酚酸B促进血管生成的作用可能与此作用有关，为后续的深入研究提供了方向。
综上，本研究中成功建立了一个基于斑马鱼模型的“虚拟筛选-活性评价”的药物筛选方法，并发现丹参中丹酚酸B是发挥促进血管生成作用的关键成分，为丹酚酸B应用于冠心病的防治以及新药研发提供科学依据。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
