摘要
随着分子遗传学技术的进步尤其是高通量测序技术的广泛应用，遗传性肌肉疾病致病基因的检测得到了普及，但在变异位点致病性的判定以及疾病分子机制和干预药物的研究方面仍面临着许多问题和挑战。国内肌病领域利用斑马鱼等模式生物开展的研究尚有限，而斑马鱼肌肉发育相关的基因保守性高，遗传操作方法丰富，运动行为表型的评价也相对容易，可作为遗传性肌肉疾病研究的有力工具。本文就斑马鱼作为遗传性肌病模式生物的优势、具体应用及局限性进行讨论，以期能够推动相关研究，并使遗传性肌肉疾病患者获益。
目前国内遗传性肌肉疾病致病基因的检测逐渐得到普及，为此类疾病的精准诊断提供了重要的技术支撑，但高通量测序发现了大量临床意义未明的变异位点，其致病性判定仍然面临着巨大挑战，针对肌病领域的治疗药物和干预措施的研究也较为少见。斑马鱼自20世纪90年代作为模式生物引入我国后，在发育生物学、毒理学和遗传学等领域得到了广泛应用，但多被应用于造血、心血管等相关疾病。近年来斑马鱼遗传操作技术不断发展，斑马鱼作为遗传性肌肉疾病的模型在变异位点致病性验证和干预措施研发方面呈现出巨大潜力。本文就斑马鱼作为遗传性肌病模式生物的优势、具体应用及局限性做一述评，以期为肌肉疾病领域的研究者提供新的思路。
一、斑马鱼作为模式生物应用的优势
斑马鱼作为模式生物的使用最早可追溯至20世纪60年代［1］，最初被应用于脊椎动物发育的研究。自20世纪80年代以来，随着斑马鱼全基因组测序的完成与基因编辑操作技术的发展［2］，斑马鱼作为模式生物被广泛应用于研究基因功能、探讨致病基因的作用机制、建立疾病模型用于治疗药物的筛选等。斑马鱼是重要的脊椎动物模型，同时又具有无脊椎动物的某些典型特征，填补了细胞培养和啮齿动物之间的空白。
（一）斑马鱼遗传操作技术方法快捷
近年来，斑马鱼模式生物主要是通过反向遗传学原理进行造模。采用斑马鱼胚胎显微注射技术向1~4细胞期的胚胎中注射吗啉环修饰的吗啉代反义寡核苷酸（morpholino，MO），干扰mRNA前体剪切或翻译，可以短暂抑制特定基因的表达，一般维持3 d左右。这种反义寡核苷酸技术主要应用于暂时性敲降在斑马鱼早期胚胎发育中有表达的目的基因，快速简便。而采用基因编辑技术则可产生稳定突变体的斑马鱼，包括锌指核酸酶（zinc finger nucleases）技术、转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases）技术以及CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9（CRISPR-associated protein 9）技术。通过基因工程改造的核酸酶可以精确靶向诱导双链 DNA 断裂（double strand break），诱导生物体通过非同源末端连接（non-homologous end joining）或同源重组（homology-directed repair）方式进行修复，从而实现定点敲除、插入、缺失或者碱基置换，以达到构建永久性基因敲入/敲除斑马鱼模型的目的。向斑马鱼早期胚胎注射DNA或RNA可实现外源基因短期过表达，而利用转基因技术可构建稳定遗传的插入品系，调控靶基因的持续表达，从而研究目的基因的生物学功能。
（二）斑马鱼肌肉表型分析可实现多元化和客观量化
斑马鱼具有典型的运动行为，易于观察和评价，肌肉发育迅速，在受精后17 h开始自发收缩。到了受精后24 h，肌节开始出现，胚胎能够卷曲甚至对触碰作出反应。受精后48 h肌肉分化完全，幼鱼在受精后96 h可自由游动［3］。利用胚胎自发卷绕和触碰诱发的幼鱼逃避反应，可以简单直接地评估斑马鱼肌病模型的运动功能［4］。也可通过视频记录一定时间内斑马鱼的游动轨迹，分析其运动距离和运动时间，以比较运动能力的改变。
斑马鱼有较为完整的评价体系来评估其肌肉结构。骨骼肌在斑马鱼躯干中占相当大的比例，其肌节的超微结构和收缩特性均与人类肌肉有着极高的相似性［5］。斑马鱼骨骼肌高度有序的肌节形状在偏振光下显得明亮，其双折射特性使肌肉结构损伤的定量评估成为可能。研究人员可以通过双折射分析在活体或固定标本上快速、无创地评估肌肉结构的破坏情况［6］。斑马鱼的胚胎透明特性有利于肌肉发育的监测，利用转基因技术可以将外源荧光蛋白基因单独或作为融合蛋白的一部分导入斑马鱼胚胎，目前已有较为成熟的标记斑马鱼肌肉结构的转基因斑马鱼系如Tg2（smyhc1：EGFP）［7］。也可利用免疫组织化学、免疫荧光技术进行斑马鱼肌病模型中肌纤维和肌节结构缺陷的观察。
二、斑马鱼作为模式生物在遗传性肌肉疾病研究中的应用
遗传性肌病新的致病基因及众多意义未明的变异位点的致病性都亟需动物模型验证，同时，此类疾病治疗手段的匮乏也要求强大的筛选平台以支持干预措施的研究。鉴于以上斑马鱼作为模式生物的显著优势，如能推动斑马鱼在遗传性肌肉疾病领域的应用，可以更好地应对基因检测技术普及带来的机遇与挑战，促进遗传性肌肉疾病致病机制的研究及潜在药物的发现。下面简述斑马鱼作为肌肉疾病模式生物代表性的研究应用，以启发科研工作者开拓视野，促进研究领域学术发展。
（一）遗传性肌肉疾病致病基因的验证
遗传性肌肉疾病多具有显著的遗传异质性，尤其是肌营养不良、先天性肌病等［8］，这些疾病的症状往往相互重叠，仅通过临床表型无法准确判断疾病的亚型，因此需要借助分子遗传学手段进行精准诊断，并以此为基础开展遗传咨询和产前诊断。另外，随着基因检测成本的降低，研究者发现了大量临床意义未明的变异，持续不断地扩大着肌病相关的基因突变谱系。然而，未报道过的新基因或变异位点需慎重判断其致病性，有效的动物模型往往能提供可靠的证据。
斑马鱼骨骼肌生长和发育过程高度保守，80%以上与人类肌肉疾病有关的基因都可以在斑马鱼基因组中找到同源基因，包括编码抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物、兴奋-收缩耦联组分等基因［9, 10, 11］，这意味着斑马鱼非常适合作为构建遗传性肌肉疾病的模型。另一方面，相较于国内常用的小鼠模型，斑马鱼体外受精易于对胚胎进行遗传学操作，降低了建模难度。另外，一对健康成年斑马鱼一次交配可产卵200枚以上，产卵间隔仅1周，且发育迅速，极大地缩短了模型构建周期。
（二）遗传性肌肉疾病致病机制的研究
相对于细胞和组织层面，利用斑马鱼来研究疾病的分子机制是在体内模型的层面，更容易得出让人信服的结论，可在一定程度上替代体外模型。借助整胚原位杂交技术、免疫荧光技术等，能在胚胎组织或细胞结构不被破坏的条件下，从整体上把握肌病背景下相关分子mRNA及蛋白水平的改变。荧光探针技术可实现在斑马鱼活体水平标记疾病相关靶点，并可在病理状态下观察其动态改变。
此外，斑马鱼信号传导通路与人类近似，氧化应激水平增加与RyR1相关肌病、自噬功能受损与肌原纤维肌病等都得到了斑马鱼模型证据的支持。ryr突变幼鱼细胞应激相关的部分通路发生了显著改变，特别是氧化应激标记基因表达的增加［12］。Bag3缺乏的斑马鱼肌肉电镜下可观察到自噬囊泡结构异常，诱导自噬流后免疫印迹显示自噬标志物微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ积聚减少，表明其自噬活性受损［13］。
（三）遗传性肌肉疾病治疗靶点的筛选
结合高通量测序及肌肉病理分析，遗传性肌病大多数已经可以得到精准诊断，但绝大部分遗传性肌病仍然缺乏有效的干预手段，相当一部分患者并未因精准诊断而获益，因此遗传性肌病未来研究的重点应该放在新型药物研发和基因治疗等领域。斑马鱼模型既可以像体外实验那样对作用靶点明确的候选化合物进行靶向筛选，也可以像哺乳动物一样对靶点不明或致病机制不明的疾病进行基于药效学的干预药物筛选和评价，能够提高药物早期药效学评价的灵敏性和可靠性，还可以进行基因编辑治疗的探索。如果能将斑马鱼模型和哺乳动物模型相结合，可以从整体上缩短干预药物或措施的研发实验周期，降低成本和风险，提高研发效率。
与啮齿类动物相比，斑马鱼易饲养、体积小，其胚胎可以在96孔或384孔板中培养。而且在培养皿中的斑马鱼胚胎可以直接吸收添加至培养液中的药物，适合进行中到高通量的药物筛选的初步研究。基于斑马鱼的迪谢内肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）模型已筛选了超过4 500种小分子化合物［14］，发现了至少25种有效药物，如非选择性磷酸二酯酶抑制剂氨茶碱［15］、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂氟西汀［16］、靶向血红素加氧酶信号通路的西地那非［17］等。除上述靶向参与DMD发病机制相关途径来改善肌肉功能和质量，斑马鱼模型也适用于评价基因组编辑疗法、基因产物修饰如外显子跳跃和终止密码子通读等基因治疗策略。有研究者向dystrophin基因无义突变的斑马鱼胚胎中注射影响转录物剪接的MO，将携带突变的外显子从成熟的mRNA中去除，恢复了部分dystrophin蛋白的功能，斑马鱼肌节结构显著改善，从而证实了外显子跳跃治疗策略的可行性［18］。
三、斑马鱼模型应用的局限性
首先，斑马鱼组织解剖结构与人类的相似性不如小鼠，如哺乳动物快肌与慢肌相间分布，而斑马鱼快肌与慢肌在位置上完全分离。其次，针对斑马鱼的抗体种类较少，定制斑马鱼抗体耗时且成本较高，一定程度上限制了分子机制的研究。此外，浸泡给药方式无法准确控制药物摄取量，斑马鱼的药物代谢系统与人类有一定差异，给药物临床转化带来困难。另外，斑马鱼肌肉疾病模型的质量控制尤为重要，不能仅以斑马鱼形态和运动功能等非特异性改变为评价标准，必须有如杆状体、中央核或轴空等病理组织化学特征以及dystrophin蛋白的表达缺失等分子病理特征支持［19, 20］，以产生符合人类疾病特征又可扩展用于高通量药物筛选的可靠疾病模型。
四、展望
由于斑马鱼模型在遗传和胚胎操作以及肌肉结构和功能评价方面的优势，近年来备受研究人员青睐，在国际上已被广泛应用于肌肉疾病发病机制的研究和治疗开发，且已取得了一系列令人振奋的研究成果。展望未来，生命与健康领域中最富创造力的将是新药研发，斑马鱼模型凭借体外细胞培养和其他模式动物不可替代的独特优势，将成为大规模化学药物筛选和探索基因治疗的强大工具，也必将为人类逐渐征服遗传性肌肉疾病发挥重要作用。
