基因组编辑(GenomeEditing)技术指的是通过使用工程核酸内切酶或称“分子剪刀”在有机体的基因组中实现DNA片段的插入、删除或者替换,是新近发展起来的一项革命性的遗传工程方法。2008年,基因组编辑技术获得了关键性突破,使用锌指核酸内切酶(ZFN)技术(第一代基因组编辑技术)首先获得了对基因组定向破坏的斑马鱼突变新品系。随后这一技术获得了爆发性的进步。2012年转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术(第二代基因组编辑技术)由于其设计和构建比ZFN技术简便,成功率高,可广泛地应用于任何动植物基因组的修改(靶向删除或定点插入)等特点,被科学(Sci- ence)杂志选列为2012年全球十大科技进展之一。 2013年1月,更为简单的CRISPR/Cas9(成族重复间隔短回文序列)系统被用于基因组编辑。作为第三代基因组编辑技术,CRISPR/Cas9技术简单、高效、且没有物种限制,因而迅速风靡全球,被Science列为2013年十大科技进展之一,2015年再被Science列为十大科技进展之首。现在,CRISPR/Cas技术已广泛应用于人、大小鼠、斑马鱼、果蝇、猪、羊、水稻、小麦和拟南芥等动植物(细胞)、酵母和蘑菇等真菌以及细菌等微生物的基因组靶向改造,成为后基因组时代的功能基因组研究、动植物品种改良、疾病模型建立以及基因治疗等不同领域开展基础研究与应用研究的遗传工程利器 CRISPR/Cas9基因组编辑工具系统涉及到sgRNA和Cas9两种成分。在细胞内,Cas9蛋白在单一的向导RNA(sgRNA)引导下识别并切割基因组上的目标靶位点,从而在基因组上人为定向制造出双链断裂(DSB)。DSB一旦形成,会激发细胞内源性的DNA损伤修复机制以修复DSB。 细胞内的DNA修复包括非同源末端连接修复(NHEJ)、微同源介导的末端连接修复(MMEJ)和同源重组修复(HR)等三种主要形式。前两种修复均为易错修复,修复的结果是在DSB附近形成插入/缺失突变。如果插入/缺失突变是个移码突变且发生在关键功能结构域对应的外显子上,则可能使目标基因因移码而不能编码出有活性的蛋白,从而成为一种无效等位基因,结果导致基因敲除;如果同时向细胞内提供同源供体,这些供体会有机会被当作用于DSB修复的同源供体,结果细胞通过HR修复,成功实现在指定位置的基因敲入。
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